Machbarkeitsstudien der multimodalen nichtlinearen Endoskopie unter Verwendung von Multicore-Faserbündeln für das Fernscannen von Gewebeschnitten bis hin zu großen Organen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13779 (2023) Diesen Artikel zitieren

283 Zugriffe

4 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Hier berichten wir über die Entwicklung und Anwendung einer kompakten mehrkernigen optischen Fasersonde für die multimodale nichtlineare Bildgebung, die die markierungsfreien Modalitäten der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung, der Erzeugung zweiter Harmonischer und der durch zwei Photonen angeregten Fluoreszenz kombiniert. Sonden mit diesem mehrkernigen Faserdesign vermeiden bewegliche und spannungsführende Teile am distalen Ende und bieten so eine vielversprechende verbesserte Kompatibilität mit klinischen Anforderungen im Vergleich zu konkurrierenden Implementierungen. Die Leistungsmerkmale der Sonde werden anhand dünner Kryoschnitte und künstlicher Ziele ermittelt, bevor die Anwendbarkeit auf klinisch relevante Proben anhand von Ex-vivo-Massendarmgeweben von Menschen und Schweinen bewertet wird. Nach der Bildrekonstruktion, um der inhärent pixeligen Natur der Daten entgegenzuwirken, zeigen die aufgenommenen Bilder eine hohe Bildqualität und morphochemische Konformität auf Gewebeebene im Vergleich zu multimodalen nichtlinearen Bildern, die mit einem Laser-Scanning-Mikroskop unter Verwendung eines Standard-Mikroskopobjektivs aufgenommen wurden. Darüber hinaus wird ein einfaches, aber effektives Rekonstruktionsverfahren vorgestellt und gezeigt, dass es zufriedenstellende Ergebnisse liefert. Abschließend wird ein klarer Weg für weitere Entwicklungen skizziert, um die Umsetzung der multimodalen Fasersonde in die klinische Bewertung und Anwendung in der Praxis zu erleichtern.

Die markierungsfreie In-vivo-Bildgebung von Geweben, die sowohl morphologische als auch chemische Informationen liefert, ist für viele geplante medizinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung, insbesondere für eine intraoperative, nicht-invasive histopathologische Untersuchung von Gewebe. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Kombination verschiedener spektroskopischer Techniken in einem multimodalen Bildgebungsansatz von Vorteil ist, um alle Anforderungen an Geschwindigkeit, Eindringtiefe und molekulare Spezifität zu erfüllen1,2,3. Ein solcher Ansatz ist die kohärente Anti-Stokes-Raman-Scattering-Mikroskopie (CARS), die gleichzeitig die beiden anderen nichtlinearen Effekte, Two-Photon Excited Fluoreszenz (TPEF) und Second Harmonic Generation (SHG), in einem einzigen Bildgebungsgerät erzeugt. CARS ermöglicht die Kartierung einer spezifischen molekularen Schwingung, wobei die am häufigsten gewählten Schwingungen überwiegend Lipide (z. B. ~ 2855 cm−1, νs(CH2)) oder Proteine (z. B. ~ 2930, νs(CH3)) anzeigen, beides sind in biologischen Proben reichlich vorhanden. Im Gegensatz dazu kann TPEF verwendet werden, um endogene Autofluorophore zu bekämpfen, insbesondere NAD(P)H, das aufgrund seiner Bedeutung für den Zellstoffwechsel in Geweben allgegenwärtig ist. Darüber hinaus ist SHG ein Prozess, der nur in nicht zentrosymmetrischen Materialien auftritt, was ihn sehr spezifisch für quasikristalline Biomaterialien wie Kollagenfasern oder Myosinfilamente macht. Somit liefert die Kombination dieser drei nichtlinearen Modalitäten auf markierungsfreie Weise wertvolle Einblicke in die Morphochemie eines Gewebes.

In diesem Zusammenhang haben wir gezeigt, dass die multimodale nichtlineare Mikroskopie, die CARS, SHG und TPEF kombiniert, die Erkennung charakteristischer Strukturen und der damit einhergehenden molekularen Veränderungen weit verbreiteter Krankheiten, insbesondere Krebs, ermöglicht4,5. Um die Interpretation von CARS/SHG/TPEF-Bilddaten zu erleichtern, können fortschrittliche Bildverarbeitungsalgorithmen automatisch charakteristische Eigenschaften extrahieren6,7. Zusätzlich und neben der automatischen Auswertung konnte gezeigt werden, dass die in diesen labelfrei aufgezeichneten multimodalen Bildern kodierten Informationen auch durch multivariate Statistik in rechnerische Hämatoxylin- und Eosin (H&E)8-Bilder übersetzt werden können, was nicht nur auf den vorhandenen Datenbestand zurückgreift Wissen und Ausbildung medizinischer Fachkräfte, könnten aber auch zur Übergangsakzeptanz beitragen. Um solche computergestützten H&E-Bilder zu erzeugen und/oder eine automatisierte Auswertung multimodaler nichtlinearer Bilddaten – einschließlich Krankheitseinstufung oder visueller Segmentierung als Grundlage für die weitere klinische Entscheidungsfindung – vor Ort und direkt während der Operation bereitzustellen, werden kompakte handgehaltene endoskopische Geräte eingesetzt sind erforderlich. Mit Anwendungsszenarien, die von der Erkennung von Tumorrändern in chirurgischen Wunden bis hin zur Symptomuntersuchung und Krankheitserkennung, -einstufung und -überwachung in Hohlorganen (z. B. entzündliche Darmerkrankung9) reichen, war die Entwicklung endoskopischer Geräte für die nichtlineare spektroskopische Bildgebung ein Thema von großem Interesse für viele Jahre. Es wurden verschiedene Ansätze vorgestellt: Neben punktuellen Scansonden10 sind die gebräuchlichsten Scanfaserendoskope11,12,13,14,15,16,17,18 und die Verwendung von Galvo-Scanning-Spiegeln oder mikroelektromechanischen Systemscannern (MEMS)19,20,21, 22,23,24.

Während punktabtastende Sonden keine räumlichen Informationen liefern, enthalten die anderen Gerätetypen empfindliche bewegliche optomechanische Teile, wodurch sie auf lange Sicht anfällig für Fehlausrichtungen und Betriebsausfälle sind, was sich negativ auf ihre Zuverlässigkeit auswirkt und eine regelmäßige Wartung durch qualifiziertes Personal erforderlich macht. Besonders besorgniserregend sind in diesem Zusammenhang die widrigen Bedingungen typischer Sterilisationsverfahren, wie z. B. Autoklavieren, sowie mechanische Kräfte, die bei der allgemeinen Handhabung auftreten können. Der Einsatz von Scangeräten im Sondenkopf kann vermieden werden, indem mehradrige Bildgebungsfasern zur Abgabe der Anregungslaserimpulse verwendet werden. Diese bildgebenden Fasern, wie die FIGH-10-500N von Fujikura Ltd. Japan, bestehen aus mehreren tausend kohärenten Lichtleitelementen, die die räumliche Beziehung zwischen den beiden Faserenden bewahren. Es wurde gezeigt, dass diese Faserbündel für Bildgebungszwecke verwendet werden können, indem das Laserscanverfahren vom distalen zum proximalen Ende der Faser verlagert wird25,26,27,28,29,30. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass mit solchen Faserbündeln auch CARS-Bildgebung möglich ist31 und dass die Integration in eine kompakte Fasersonde durch die Verwendung von Gradientenindexoptiken (GRIN)32 möglich ist. Um die zeitliche und spektrale Verbreiterung abzuschwächen, wird jedoch empfohlen, einen Pikosekundenlaser als Anregungsquelle zu verwenden. Die mit Gradientenindexoptiken (GRIN) und optischen Fasern verbundenen Dispersionseigenschaften, insbesondere bei Verwendung mit einem Femtosekundenlaser, wurden gründlich untersucht und sind in der zitierten Literatur in33 zu finden. Zusätzlich zu den erwarteten Vorteilen hinsichtlich der Langzeitstabilität einer solchen Sonde vermeidet das rein optische Design alle stromführenden Teile im Sondenkopf, während die oben genannten Scan-Ansätze hohe Spannungen erfordern, was eine Bewertung potenzieller Risiken erforderlich macht für den Patienten und dürfte die Zulassung der Technologie erschweren.

Trotz der offensichtlichen Attraktivität dieses Ansatzes stellen frühere Arbeiten32 unserer Gruppe unseres Wissens nach immer noch das einzige veröffentlichte Beispiel eines kohärenten Endoskops auf Faserbündelbasis dar, das die gleichzeitige Aufzeichnung von CARS, TPEF und SHG demonstrierte. Während TPEF und SHG deutlich einfacher zu implementieren sind, blieb CARS – obwohl es eine besonders wünschenswerte Modalität für die Analyse biologischer Proben ist – eine Herausforderung. Da der Schwerpunkt dieser früheren Studien31,32 jedoch hauptsächlich auf der technischen Umsetzung, Charakterisierungsaspekten und einigen Proof-of-Concept-Bildern dünner Gewebeschnitte mit geringer Wiedergabetreue lag, stellen sich Fragen hinsichtlich der allgemeinen Anwendbarkeit auf reale Proben unter praktischen Aspekten , die erreichbare Bildqualität und geeignete Datenverarbeitungsroutinen werden noch unzureichend berücksichtigt. In diesem Beitrag werden ein verbessertes Sondendesign und eine verbesserte Datenanalysestrategie vorgestellt, die die Anwendung auf medizinisch relevantere Proben und Szenarien ermöglichen.

Nach einem kurzen Überblick über das Sondendesign einschließlich seiner technischen Verbesserungen werden zunächst allgemeine Leistungsmerkmale, insbesondere hinsichtlich der optischen Auflösung, ermittelt. Anhand eines getrockneten Dünnschnitts menschlichen Kopf- und Halskrebsgewebes als wohldefinierte biologische, flache Probe, die in allen drei Kanälen Kontrast liefert, wird die Konformität mit LSM-basierten Messungen (Laser-Scanning-Mikroskop) analysiert. Anschließend wird eine Reihe von Messungen an Polymerkügelchen unterschiedlicher Größe vorgestellt, um die optische Auflösung und ihre Einschränkungen aufgrund spärlicher Probenahme zu beurteilen. Die Auflösung ist begrenzt, wenn einer spärlichen Abtastung durch einzelne Faserkerne dadurch entgegengewirkt wird, dass mehrere räumlich verschobene Messungen analysiert werden. Diese Ergebnisse werden an einem dünnen Schnitt murinen Lebergewebes getestet. Nachdem die Leistungsmerkmale ermittelt wurden, konzentriert sich der zentrale Teil der vorgestellten Studie auf zwei Aspekte: Bildrekonstruktion, um leicht lesbare Bilder zu liefern, und die Anwendbarkeit der Sonde auf umfangreiche Proben, die repräsentativer für das geplante Anwendungsszenario von In-vivo-Messungen für Spektralmessungen vor Ort sind Histopathologie. Zu diesem Zweck werden Darmwandsegmente von Schweinen und Menschen ex vivo als realitätsnahe, medizinisch relevante Proben untersucht.

Die Fasersonde und der allgemeine Versuchsaufbau einschließlich Lichtquellen, LSM und der Dreikanal-Detektionsaufbau wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben32. Das Schlüsselelement der Fasersonde ist die kohärente Abbildungsfaser bestehend aus ca. 10.000 Einzelkernen (FIGH-10-500N, Fujikura Ltd. Japan) zur Lieferung der Anregungslaserstrahlen sowie ein optisches System zur Bildfeld- und Farbkorrektur. Hier haben wir ein verfeinertes Sondendesign mit technischen Verbesserungen in Bezug auf Laserbeleuchtung und Signalerfassungseffizienz angewendet. Während sich frühere Studien auf CARS konzentrierten, wurde für die Zwecke dieser Arbeit der zuvor verwendete Langpassfilter (LP02-830RE, Semrock, USA) gegen einen dichroitischen Strahlteiler (Di02-R785) ausgetauscht, um eine optimale Leistung auch im TPEF- und SHG-Kanal sicherzustellen ), das eine höhere Transmission (> 90 %) im Wellenlängenbereich von 400–780 nm bietet. Die GRIN-Linse und die DOE-Baugruppe wurden mit strengeren Toleranzen hergestellt, wodurch Vignettierung und chromatische Fehler der Pump- und Stokes-Strahlen minimiert werden. Darüber hinaus wurde der Sondenkopf mit einem neuen Metallgehäuse verfeinert, um die ansonsten empfindliche Faserverbindung zu schützen und zu verstärken. Aus dem gleichen Grund wurden an den Fasern Endoskopschläuche und SMA-Anschlüsse angebracht, die nach der Medical Device Regulation (MDR) zugelassen sind. Ein selbstgebautes LSM wurde zur Kopplung der von einem 80 MHz modengekoppelten Nd:VAN-Laser (picoTRAIN, High Q Laser, Österreich) erzeugten Anregungslaserimpulse in Kombination mit einem optisch parametrischen Oszillator (Levante Emerald, APE, Deutschland) verwendet. bei 816 nm (Pumpe) und 1064 nm (Stokes) in die Bildfaser34. Dieses Wellenlängenpaar entspricht einer Raman-Resonanz von 2850 cm−1 und entspricht der symmetrischen Streckschwingung von CH2-Gruppen, die besonders häufig in Lipiden vorkommen, was zu einem CARS-Signal bei 661,8 nm führt. Als Anregungswellenlänge für die SHG-Modalität verwendeten wir den 1064-nm-Strahl, während beide Strahlen als Anregungsquelle für die TPEF-Modalität dienten. Das proximale Ende der Bildfaser wird in der Brennebene des LSM platziert, wo es von zwei Galvospiegeln in einem dichten Rastermuster abgetastet wird, während das distale Ende der Sonde an der Gewebeprobe platziert wird. Der volle Bildkreisdurchmesser beträgt ca. 460 µm. Allerdings wird ein reduziertes Scanfeld (ca. 260 µm) im zentralen Bereich der Bildfaser verwendet, um beschädigte Kerne in der Faser zu vermeiden, die möglicherweise während des Herstellungsprozesses der Bildfaser entstanden sind Sondenkopf. Die Leistung der Laserstrahlen am Probenort betrug etwa 50 mW für Pump und 25 mW für Stokes bei der Sondenmessung und 70 mW für Pump und 40 mW für Stokes bei LSM-Aufnahmen. Die durchschnittliche Laserleistung, die für die nichtlineare endoskopische Bildgebung verwendet wurde, lieferte eine ausreichende Signalerzeugung aus den präsentierten Proben, ohne sichtbare Schäden an ihnen zu verursachen, und stimmt mit den Leistungsskalen überein, die in vergleichbaren nichtlinearen endoskopischen Bildgebungsanwendungen18,35 unter Verwendung von Pikosekunden-Laserimpulsen verwendet werden. Einen nützlichen Bezugspunkt in diesem Zusammenhang liefern Galli et al.36, die Lichtschäden unter ähnlichen Anregungsbedingungen als Funktion der aufgezeichneten Bildwiederholungen untersuchten. Ein schematischer Aufbau des an die Sonde gekoppelten LSM ist in Abb. 1a dargestellt. Abbildung 1b zeigt den internen optischen Aufbau des Sondenkopfes. Zwei dichroitische Kerbstrahlteiler (NFD01-532 (Semrock, USA) und F73-067 (Chroma, USA)) und drei Bandpassfilter (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) und FF01 -550/88 (Semrock, USA)) wurden zusätzlich zu einem Kurzpassfilter (FESH0700, Thorlabs, USA) zur Trennung der Probensignale verwendet. In der aktuellen Design-Iteration sind alle Optiken für eine Messung durch 170 µm Glas ausgelegt. Für eine einfachere Prototypenerstellung und mehr Vielseitigkeit in der Testphase enthält das aktuelle Design kein festes Glasfenster und verlässt sich stattdessen auf ein Deckglas, das auf der Probe platziert wird. Das Sondendesign ist weitgehend unabhängig vom verwendeten spezifischen LSM und könnte beispielsweise mit einem kompakten faserbasierten Lasersystem und einem Scankopf gekoppelt werden, um in eine Mobilstation integriert zu werden, wie kürzlich für ein nichtlineares Endoskop mit starrem Körper gezeigt wurde35. Einen Überblick über die wichtigsten Struktur- und Leistungsmerkmale der Sonde finden Sie in Tabelle 1.

(a) Versuchsaufbau mit einem an die Sonde gekoppelten Laser-Scanning-Mikroskop. Die Anregungslaser werden mithilfe eines Laser-Scanning-Mikroskops in die bildgebende Faser eingekoppelt. Das Licht wird von der Bildfaser übertragen und vor dem Sondenkopf fokussiert, wo das nichtlineare Signal innerhalb der Gewebeprobe erzeugt wird. Das Signal wird von einer Multimode-Faser gesammelt und zu einem Detektionsaufbau mit drei gleichzeitigen Detektionskanälen geleitet. (b) Design der internen Fasersonde. (c) H&E-gefärbtes Bild eines Krebsgewebes im Kopf- und Halsbereich. Zuordnung: Plattenepithel (SE), Bindegewebe (C) und Region der Tumorzellen (TC). (d) Vergrößerte und detaillierte Ansicht des in (c) markierten Bereichs. (e) Multimodales Bild derselben Region, aufgenommen mit einem herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskop. (f) Zusammengeführte Serie der unverarbeiteten Fasersondenbilder derselben Region. (g) Das gleiche Bild wie in (f) nach Anwendung eines im Abschnitt „Bildverarbeitung“ vorgestellten Bildverarbeitungsalgorithmus. (h–j) Vergrößerte und detaillierte Ansicht der in (e), (f) bzw. (g) markierten Bereiche. Farbcodierung: Rot – CARS, Blau – SHG, Grün – TPEF. Kachelgröße in Fasersondenbildern: 207 × 207 µm2.

Um die Leistung der verfeinerten Sonde als endoskopisches Bildgebungsgerät zu demonstrieren, wurde ein menschlicher Gewebeschnitt von Kopf- und Halskrebs (20 µm, luftgetrockneter nativer Kryoschnitt) abgebildet. Die Sonde wurde direkt über dem dünnen Gewebeschnitt platziert und von einem motorisierten Tisch bewegt. Abbildung 1f zeigt eine zusammengeführte multimodale Bildserie (12 x 12 Kacheln, 190 µm seitliche Verschiebung) ohne Nachbearbeitung, mit Ausnahme geringfügiger Helligkeitsanpassungen für eine ordnungsgemäße Visualisierung. Die Bilder wurden erheblich überabgetastet, um maximale Flexibilität bei der Datenverarbeitung und eine Basis für die erreichbare Bildqualität zu gewährleisten. Die Erfassungszeit für eine einzelne Kachel betrug 32 s bei einer digitalen Auflösung von 2048 x 2048 Pixeln mit einer Pixelverweilzeit von 2 µs und einer vierfachen Bildmittelung. Unter einigen Annahmen und Näherungen kann das maximale Signal-Rausch-Verhältnis für einen einzelnen Frame auf 52 für CARS und 11 für TPEF/SHG geschätzt werden (Einzelheiten siehe SI). Im Vergleich zu den vorherigen Ergebnissen32 zeigt das verfeinerte Sondendesign eine deutlich höhere Signalsammeleffizienz für alle drei nichtlinearen Modalitäten. Das in Abb. 1f gezeigte multimodale Bild spiegelt die morphochemische Struktur des menschlichen Kopf- und Halskrebsgewebes wider, bestehend aus ausgeprägtem CARS aus lipidreichen Strukturen, TPEF aus endogenen Autofluorophoren (Elastin, NADH, FAD) und SHG aus Kollagenfasern. Die Morphologie des Gewebes korreliert gut mit einem H&E-gefärbten Bild desselben Gewebeabschnitts, einschließlich Plattenepithel (SE), Bindegewebe oder Stroma (C) und Regionen mit Tumorzellen (TC) in Abb. 1c,d. Wir konnten CARS- und TPEF-Signale im Epithelbereich erfassen, der Lipiden und Elastin entspricht, die auch im Rest des Gewebes sichtbar sind. Darüber hinaus können Kollagen- und Elastinfasern als Kombination von SHG- und TPEF-Signalen (in hellblauer Farbe sichtbar) im Bereich des Bindegewebes gut sichtbar gemacht werden, was durch H&E-Färbung bestätigt wird. Der gleiche von der Sonde untersuchte Bereich wurde von einem herkömmlichen LSM (Abb. 1e) mit den gleichen Scanparametern aufgezeichnet, die oben zum direkten Vergleich beschrieben wurden, mit dem einzigen Unterschied, dass eine seitliche Verschiebung von 550 µm ein größeres Sichtfeld ermöglicht. Es ist ersichtlich, dass die beobachtete Morphochemie im LSM-Bild (Abb. 1e) gut mit der mit der Fasersonde aufgezeichneten übereinstimmt (Abb. 1f). Allerdings zeigt das mit der Sonde aufgenommene Bild im Vergleich zum LSM-Bild eine eher pixelige Struktur mit geringerer räumlicher Auflösung aufgrund des mehradrigen Aufbaus der Bildfaser (siehe Abb. 1e,f). Ein der Pixelisierung entgegenwirkender Bildverarbeitungsalgorithmus (der später ausführlich beschrieben wird) wurde entwickelt und zur Korrektur der pixeligen Struktur angewendet. Das Ergebnis ist in Abb. 1g dargestellt. Es ist ersichtlich, dass das Design der Fasersonde in Kombination mit geeigneten Bildverarbeitungsalgorithmen ein multimodales nichtlineares Bild des dünnen Gewebeschnitts erzeugt, dessen Bildqualität mit der des herkömmlichen LSM vergleichbar ist. Bemerkenswert ist, dass Tumorregionen im TPEF-Kanal aufgrund der erhöhten Autofluoreszenz deutlich heller erscheinen als umgebende gesunde Regionen, was mit früheren Berichten für Kopf- und Halskrebsproben übereinstimmt und somit die morphochemische Konformität unterstreicht6,37. Im folgenden Abschnitt wird der Einfluss dieses Pixelisierungseffekts auf die optische Auflösung des Sondenkopfes bewertet.

Der Vergleich zwischen den mit dem LSM und der im vorherigen Abschnitt besprochenen Fasersonde aufgenommenen Bildern (siehe Abb. 1e vs. f) zeigt eine Einschränkung der Fasersonde, nämlich die pixelige Bildstruktur. Im Folgenden wollen wir die optische Leistung des Sondenkopfes hinsichtlich des Einflusses dieser Pixelierung auf die räumliche Auflösung innerhalb der Fokusebene bewerten. Zu diesem Zweck wurde eine polychromatische Punktspreizfunktion (PSF) für alle im Sondenkopf integrierten Optiken mit Ausnahme der Bildfaser simuliert. Der Simulation zufolge führt eine idealisierte Punktquelle auf der Objektebene zu einem FWHM-Spotdurchmesser von 1,6 µm in der Bildebene der Sonde. Um die tatsächliche Fokusgröße abzuschätzen, muss die Abbildungsfaser mit ihren einzelnen Kerndurchmessern im Bereich von 2,2 bis 3,7 µm berücksichtigt werden. Durch Faltung des simulierten PSF mit dem mittleren Kerndurchmesser von 2,9 µm38 kann eine tatsächliche Brennfleckgröße von 3,3 µm berechnet werden. Eine entsprechende Auflösung kann jedoch nur erreicht werden, wenn mehrere Bilder derselben Probe mit leicht verschobenen Sondenpositionen aufgenommen werden, dh kleiner als der durchschnittliche Kerndurchmesser zwischen den einzelnen Bildern. Um die rein optische Auflösungsgrenze der Fasersonde zu demonstrieren, wurden CARS-Bilder (2850 cm−1) von Clustern aus Polystyrol- (PS) und Polymethylmethacrylat-Kügelchen (PMMA) mit unterschiedlichen Durchmessern (3 µm, 6 µm und 8 µm) und a Kryoschnitte aus Lebergewebe (20 µm, Maus) wurden mit einer Positionsverschiebung von 1 µm für 100 Bilder (10 x 10 Kacheln) gemessen. Die Aufnahmezeit für ein einzelnes Bild betrug 8 s bei einer digitalen Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln, einer Pixelverweilzeit von 2 µs und einer vierfachen Bildmittelung. In Abb. 2 zeigen CARS-Bilder, die aus 10 x 10 Mustern jeder Probe überlagert wurden, eine dramatische Verbesserung durch die Rekonstruktion des Raums zwischen den Kernen. Es ist ersichtlich, dass 3-µm-Perlen (Abb. 2a, b) bei Wellenmustern zwischen benachbarten Objekten in Bereichen, in denen sie dicht gepackt sind, nicht gut aufgelöst werden, während 8-µm-Perlen (Abb. 2c) leicht aufgelöst werden, wie aus dem Vorhergehenden erwartet theoretische Vorhersagen. Dies wird noch deutlicher, wenn man sich die Intensitätsprofile (Abb. 2e) ansieht, die aus den markierten Bereichen in Abb. 2a–c ausgewählt wurden. Angesichts der inhomogenen Struktur der Bildgebung aufgrund unterschiedlicher Kerngrößen und -abstände, dicht gepackter Perlen und nichtresonantem CARS-Hintergrund ist es schwierig, einen spezifischen Wert für die räumliche Auflösung anzugeben. Abb. 2e zeigt jedoch, dass sich die Trennung zweier Maxima von 3 auf 8 µm großen Perlen deutlich verbessert. Abbildung 2d demonstriert diesen Ansatz für eine histologische Probe und visualisiert die einzigartige schwammartige Mikroarchitektur der Leber aus abwechselnden Sinusoiden (kein/geringer Kontrast) und Hepatozyten (hoher Kontrast). Eine dichte Abtastung der Ebene durch wiederholte Aufnahme räumlich verschobener Bilder bringt in diesem Fall die Auflösung auf ein leicht subzelluläres Niveau. Dadurch werden einige Kerne als dunkle runde Scheiben sichtbar (weiße Pfeile, vergleiche z. B. 39, S. 232).

CARS-Bilder von (a) PS-Perlen mit einem Durchmesser von 3 µm, (b) gemischten PMMA- und PS-Perlen mit Durchmessern von 3 µm bzw. 6 µm, (c) PS-Perlen mit einem Durchmesser von 8 µm. (c)-1 überlagertes Bild, (c)-2 eine Einzelaufnahme mit Normalisierung, (c)-3 eine Einzelaufnahme mit Normalisierung und einem FFT-Bandpassfilter. (c)-1 bis (c)-3 sind Abschnitte desselben Sichtfeldes. (d) Kryoschnitt aus Mauslebergewebe mit einer Dicke von 20 µm (rot: CARS, grün: TPEF). (e) Normalisiertes Intensitätsprofil der angegebenen Bereiche in (a–c) mit Mittelung in der Richtung senkrecht zu den Längsachsen des Rechtecks. Bereiche, die nicht von allen 100 Kacheln in (a–d) abgedeckt wurden, wurden beschnitten. Endgültige Fliesengröße: 210 × 210 µm2.

Allerdings würde die Anwendung eines solchen Aufnahmeverfahrens zu einer erheblichen Verlängerung der Gesamtaufnahmezeit führen, was für In-vivo-Messungen nicht tolerierbar ist und daher zum jetzigen Zeitpunkt überwiegend von theoretischem Interesse ist. Bei Einzelbildern bestimmen vor allem die Faserstruktur und der Abstand zwischen den einzelnen Kernen die tatsächliche Auflösung der Fasersonde. Bei einem mittleren Mittenabstand von Kern zu Kern von 4,6 µm und gemäß dem Abtasttheorem von Nyquist und Shannon hat die kleinste periodische Struktur, die die Sonde mit einem einzigen Schuss auflösen kann, eine Teilungslänge von 2,3 * 4,6 ≈ 10,6 µm (ohne Berücksichtigung). die Brennfleckgröße). Eine geringfügige Abweichung der Kerngrößen, -formen und -abstände (siehe auch Abb. S2) würde diese Zahl jedoch lokal geringfügig verändern. Obwohl diese Auflösung im Vergleich zu den in anderen Studien18,35,40,41 berichteten Auflösungen im Mikrometer- und Submikrometerbereich weniger konkurrenzfähig erscheint, ist es wichtig zu beachten, dass dieses auf Multicore-Fasern basierende Endoskop anders konzipiert wurde. Sein Hauptziel besteht darin, eine nichtlineare Bildgebung auf Gewebeebene zu ermöglichen, ohne dass elektronische und bewegliche Teile im Endoskop erforderlich sind. Die geschätzte Auflösung von 10,6 µm stimmt mit den experimentellen Ergebnissen überein, wie aus dem Vergleich eines überlagerten Bildes (Abb. 2c-1) und eines einzelnen Bildes (Abb. 2c-2, c-3) hervorgeht. Es sollte erwähnt werden, dass es für die verwendeten Wellenlängen wahrscheinlich nahezu optimal ist, da höhere Kerndichten zu einer erhöhten Kopplung zwischen Kernen führen. Die in dieser Studie verwendete FIGH-10-500N-Faser schafft ein Gleichgewicht zwischen einer relativ hohen Kern- und damit Pixeldichte und einer minimalen Kopplung zwischen den Kernen. In Kombination mit einem wünschenswerten Grad an Ungleichmäßigkeit der Kernstruktur, der das Ausmaß der Kopplung zwischen Kernen weiter minimiert, eignet es sich besonders für unsere Anwendung 26, 38 und wird zusätzlich durch die Tatsache unterstützt, dass nichtlineare Modalitäten im Allgemeinen weniger von schwachen Kernen beeinflusst werden Kopplung als lineare. Eine ausführliche Diskussion findet sich im SI, Abschnitt S8. Da das vorgestellte Sondendesign nicht auf Untersuchungen auf subzellulärer Ebene, sondern vielmehr auf die Unterscheidung verschiedener morphochemischer Strukturen auf Gewebeebene abzielt, reicht die von der Sonde bereitgestellte Auflösung für ihren Zweck aus, wie in den folgenden Abschnitten gezeigt wird. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass in einem voraussichtlichen Handbetriebsmodus und in Kombination mit genauer Positionsverfolgung oder digitalem Stitching in Echtzeit Bedingungen auftreten können, die zu den oben beschriebenen Auflösungsverbesserungen führen, während (semi-)kontinuierlich ganz natürlich Scanbewegungen.

Wie oben erwähnt, führt die Mehrkernzusammensetzung der Bildfaser zu einer pixeligen Bildstruktur (siehe Abb. 1d), was zwei nachteilige Auswirkungen hat: (1) die Gewebemorphochemie wird nicht gut dargestellt, was eine qualitative Beurteilung schwierig macht; (2) Die für Bildanalyseansätze verwendeten Texturmerkmale6,7,8 werden stark von der Pixelstruktur beeinflusst, was eine quantitative Analyse schwierig macht. Daher sind Nachbearbeitungsschritte erforderlich, um die Kernstruktur aus den Bildern zu entfernen und die Daten zu rekonstruieren. Idealerweise sollte diese Nachbearbeitung eine Korrektur der Übertragung einzelner Faserkerne ermöglichen, die Vergleichbarkeit verschiedener Bereiche in einem Bild sowie die Vergleichbarkeit zwischen Sonden gewährleisten und rechnerisch nicht zu anspruchsvoll sein, um perspektivisch eine Online-Verarbeitung zu ermöglichen . Es gibt drei grundlegende Kategorien etablierter Strategien zur Lösung des Pixelierungsproblems, das sich aus der Bildgebung mit kohärenten Faserbündeln ergibt42: räumliche Mittelungsfilter, Spektralfilterung und Interpolationsmethoden. Wir stellten fest, dass diese etablierten Methoden unbefriedigende Ergebnisse lieferten, und haben eine benutzerdefinierte Methodik entwickelt, die unten beschrieben wird. Ein detaillierter qualitativer Vergleich der Methoden basierend auf der Arbeit von Shinde und Matham42 ist im SI enthalten.

Die Rekonstruktion wird durch den in Abb. 3 dargestellten Bildkorrektur-Workflow erreicht. Als Beispiel werden 3 x 3 Kacheln aus der oberen rechten Ecke des in Abb. 1 dargestellten menschlichen Kopf- und Halsgewebes gezeigt. In einem ersten Schritt wird der ursprüngliche Bilderstapel, der aufgrund unterschiedlicher Laserkopplungsbedingungen eine Verschiebung von etwa einem Kern-zu-Kern-Mittenabstand in 100 Kacheln aufweist, einem Stapelausrichtungsverfahren unterzogen, um konsistente Faserkernpositionen in jedem Bild des Stapels sicherzustellen (Abb. 3a). Nach der Ausrichtung wird der Stapel verkleinert, um die Verarbeitungszeit bei weiteren Berechnungen zu verkürzen, wobei 2 * 2,3 Pixel pro Kern-zu-Kern-Mittelabstand erhalten bleiben (Abb. 3b). In einer streng periodischen (orthogonalen) Struktur würden 2,3 Pixel ausreichen, um die Faserkernmatrix nach dem Nyquist-Kriterium abzutasten. Der Faktor 2 berücksichtigt Schwankungen der Kerndurchmesser und eine unvollständige Kernpackung. Als nächstes wird eine mittlere Projektion (Abb. 3c) des verkleinerten Stapels berechnet, um die lokale Effizienz jedes Faserkerns abzuschätzen. Jeder Pixelwert in jedem Bild des verkleinerten Stapels wird dann durch den entsprechenden Pixelwert der Medianprojektion dividiert, um die lokalen Änderungen der Effizienz zu normalisieren (Abb. 3d). Dieses Verfahren berücksichtigt die einzelnen Kerntransmissionen, ohne dass eine externe Referenzmessung erforderlich ist. Während für dieses genaue Verfahren Rohdaten in Form mehrerer Bilder vorliegen müssen, ist zu beachten, dass die zur Normalisierung verwendete Medianprojektion nicht unbedingt aus derselben Messung stammen muss, d. h. Messungen einzelner Bilder sind selbstverständlich möglich, wenn eine alte Median-Projektionskarte verfügbar ist. Für praktische Anwendungen wäre es von Vorteil, einen laufenden Median der letzten 100 Bilder beizubehalten, da dies zu einer automatischen Kalibrierung führen würde, falls die Einkopplungsbedingungen im Laufe der Lebensdauer des Sondenkopfs leicht abweichen.

Bildkorrektur-Workflow. Als Beispiel dient ein Bereich des menschlichen Kopf- und Halsgewebes in Abb. 1. (a) Ausgerichtete Bilder mit korrigierten Kernpositionen im gesamten Stapel. (b) Bilder werden auf eine geeignete Pixelskala herunterskaliert, um Rechenzeit zu sparen. (c) Medianprojektion des verkleinerten Stapels. (d) Stapel geteilt durch die mittlere Projektion zur Normalisierung. (e) Zusammengefügtes Mosaikbild mit linearer Überblendung in überlappenden Bereichen. (f) Verarbeitetes Bild nach Anwendung eines FFT-Bandpassfilters.

Die resultierenden Bilder des normalisierten Stapels werden dann mithilfe linearer Mischung für überlappende Bereiche zu einem Mosaikbild zusammengefügt (Abb. 3e). Es wurde ein Vergrößerungsfaktor von 1,17 (Probenstelle/Einkoppelstelle) festgestellt, der wahrscheinlich auf Unvollkommenheiten bei der Ausrichtung der Optik im neu gestalteten Sondenkopf zurückzuführen ist, und sein Einfluss auf die Kachelüberlappung wird beim Zusammenfügen berücksichtigt. Im letzten Schritt wird ein FFT-Bandpassfilter angewendet, um alle verbleibenden Kernstrukturen aus dem Mosaikbild zu entfernen (Abb. 3f). Detailliertere Informationen zur Bildverarbeitung und Motivationen für die gewählten Parameter finden Sie im SI.

Unter Verwendung geeigneter Parameter (z. B. Überlappung beim Zusammenfügen von Kacheln) wurde die in Abb. 3 gezeigte Bildrekonstruktionsstrategie auf alle Fasersondenbilder in dieser Studie angewendet, einschließlich eines Hohlorgangewebes, das im folgenden Abschnitt vorgestellt wird.

Die in den vorangegangenen Abschnitten vorgestellten Ergebnisse haben gezeigt, dass die Fasersonde in Kombination mit der Bildnachbearbeitung multimodale Bilder dünner Gewebeschnitte mit hoher Qualität liefert, die die erwartete Gewebemorphochemie widerspiegeln. Im Folgenden wollen wir die Eignung des Fasersondenkopfes zur Abbildung großer Hohlorganbereiche, also von Proben von mehr als 10 mm2, wie sie beispielsweise bei der Endoskopie erforderlich sind, evaluieren. Zu diesem Zweck wurden ein Stück Dünndarmgewebe eines Hausschweins (Sus scrofa Domestica) und eine native große menschliche Dickdarmprobe als Testproben verwendet. Der Sondenkopf wurde durch eine entsprechende mechanische Baugruppe fixiert, während die Probe durch einen motorisierten Tisch in drei Achsen relativ dazu bewegt werden konnte. Mit einem solchen System kann eine zuverlässige Mosaikbildaufnahme zur Visualisierung der Morphochemie großer Gewebeoberflächen erreicht werden.

Der innere Teil des Schweinedarms, die Schleimhautschicht, wird routinemäßig nach der Schlachtung als Vorprozess für die anschließende Wurstherstellung entfernt. Um ein Austrocknen beim großflächigen Scannen zu verhindern, wurde die Probe in phosphatgepufferte Kochsalzlösung gegeben. Die Aufnahmezeit für ein einzelnes Bild bei den Schweinedarmmessungen betrug 32 s mit einer digitalen Auflösung von 2048 x 2048 Pixeln, einer Pixelverweilzeit von 2 µs und einer 4-fachen Mittelung sowohl für das Sondenbild als auch für das LSM-Bild. Auch hier wurden die Bilder erheblich überabgetastet, was die Möglichkeit bot, die Originaldaten herunterzuskalieren, um den Effekt niedrigerer Pixelauflösungen zu emulieren. Wir haben festgestellt, dass eine Reduzierung der Pixelauflösung auf 256 x 256 Pixel (entsprechend einer Bilderfassungszeit von ~ 0,5 s) außer einem etwas geringeren Signal-Rausch-Verhältnis keine nennenswerten Unterschiede im Endergebnis führt (Abb. S3). Um einen großen Bereich des Darmgewebes abzudecken, wurden 390 Bilder (26 x 15 Kacheln, 190 µm seitliche Verschiebung) mit der Sonde und 77 Bilder (11 x 7 Kacheln, 550 µm seitliche Verschiebung) mit dem LSM aufgenommen und auf die Probe zugeschnitten Bereich wie in Abb. 4b,c dargestellt. Die hellen vertikalen Linien an den Grenzen der Kacheln in Abb. 4c werden durch ein Artefakt verursacht, das auf eine leichte zeitliche Abweichung der Galvo-Spiegelbewegung während des Scannens zurückzuführen ist, was zu einer Abweichung der Kernpositionen in diesen Bereichen führt, was sich negativ auf die Normalisierung auswirkt. Für die Massenmessungen des menschlichen Dickdarms betrugen die Aufnahmezeiten für Einzelbilder 8 s und 16 s mit Pixelauflösungen von 1024 x 1024 und 512 x 512, Pixelverweilzeiten von 2 µs und 4 µs und einer 4-fachen Mittelung und 16-fachen Mittelung für Abb. 4e bzw. f. Das LSM-Bild (Abb. 4d) wurde in einem anderen LSM-System (Zeiss LSM510, Ti:Sa-Laser (Coherent, USA) bei 832 nm, gepumpt mit einem Neodym-Vanadat-CW-Laser, optischer parametrischer Oszillator (APE, Deutschland) bei 672,5 nm aufgenommen ) mit Zeiss Plan-Apochromat 20×/0,8 NA Objektiv, einer Pixelauflösung von 1024 x 1024, einer Pixelverweilzeit von 1,6 µs und 8-facher Mittelung. Einzelne Modalitäten wurden nacheinander in Epi-Richtung gemessen. Die Laserleistung an der Probe betrug 40 mW für den Pumpstrahl (672,5 nm; TPEF, CARS) und 50/200 mW für den Stokes-Strahl (832 nm; CARS/SHG). Die LSM- und Sondenbilder des menschlichen Dickdarms wurden an verschiedenen Positionen aufgenommen. Das Sondenbild in Abb. 4c zeigt hohe Beiträge aller drei nichtlinearen Modalitäten. Die in diesen multimodalen Bildern dargestellte Morphochemie korrelierte wiederum histologisch mit der anschließenden H&E-Färbung. Abbildung 4a zeigt ein H&E-Querschnittsbild der in Abb. 4c dargestellten Schweinedarmprobe zusammen mit den wichtigsten morphologischen Merkmalen einer Darmwand für die strukturelle Konformation der untersuchten Probe. Typischerweise bestehen Darmproben aus vier unterschiedlichen Schichten: Mukosa, Submukosa, Tunica muscularis und Serosa. Allerdings wurde, wie oben erwähnt, der Großteil der Schleimhautschicht des Schweinedarms vom Metzger entfernt. Daher bestand in unserer Probe die erste Schicht in Messrichtung hauptsächlich aus Submukosa und möglicherweise Resten der Schleimhaut, wie im H&E-Bild in Abb. 4a zu sehen ist. Die Submukosa besteht aus dichten, unregelmäßigen Bindegewebsschichten mit Blutgefäßen, Lymphgefäßen und Nerven, die in die obere Schleimhautschicht verzweigen. Auf den Bildern in Abb. 4b und c ist eine Kombination aus starken Signalen von Lipiden (CARS in Rot) und Kollagen (SHG in Blau) zu sehen, die zu einer violetten Farbe führen. Intensive, kolokalisierende CARS- und TPEF-Signale (gelb) weisen auf deutliche Lipidansammlungen hin, die in beiden Bildern gut sichtbar sind. Regionen mit starkem TPEF-Signal (grün) können von Elastin in der Submukosa und den Muskelschichten unterhalb der Submukosa stammen. Die allgemeine Ähnlichkeit beider Bilder ist ausgezeichnet, was darauf hindeutet, dass auf Gewebeebene gleichwertige Informationen erhalten werden können.

(a) H&E-Bild eines senkrecht zur Darmoberfläche geschnittenen Dünndarmabschnitts eines Schweins mit histologischen Schichtzuordnungen. Der Pfeil (schwarz) zeigt die gemessene Schicht (den Rest der Mukosa und Submukosa) für die LSM (b) und die Sondenaufzeichnung (c) an. (b) LSM-Bild der inneren Oberfläche einer Schweinedarmprobe, aufgenommen in der Nähe von (a). (c) Fasersondenbild nach der Bildrekonstruktion. Fliesengröße: 207 × 207 µm2. Die markierten Bereiche, rot in (b) und blau in (c), werden in drei separaten Kanälen vergrößert, um den gleichen Bereich direkt vergleichen zu können. Weiße Pfeile in CARS-Bildern der vergrößerten Ansichten kennzeichnen ein staubartiges Objekt, was darauf hindeutet, dass das Sondenbild in einer anderen Fokusebene aufgenommen wurde, was zu einem etwas anderen morphologischen Kontrast als im LSM-Bild (b) führt. (d) LSM-Bild der inneren Oberfläche eines großen menschlichen Dickdarms. In der Einfügung wurde eine Graustufendarstellung des SHG-Kanals mit individuell skalierter Helligkeit zur Berücksichtigung der geringen Intensitäten im Vergleich zu den blauen Bereichen im Hauptbild überlagert (30 % Transparenz), um die Kryptastrukturen hervorzuheben. (e) Fasersondenbild der inneren Oberfläche eines großen menschlichen Dickdarms nach der Bildrekonstruktion. (f) Fasersondenbild der inneren Dickdarmoberfläche mit abgelöster Schleimhautschicht. Fliesengröße in (e) und (f): 235 × 235 µm2. Farbcodierung: Rot – CARS, Blau – SHG, Grün – TPEF.

Der menschliche Dickdarm (Abb. 4d–f) enthält noch die Schleimhautschicht. Dementsprechend zeigt ein LSM-Bild (Abb. 4d) die typischen Kryptastrukturen, wie sie in den Kanälen CARS (rot) und TPEF (grün) sichtbar sind. Was die Schweinedarmprobe betrifft, so ist ein weiteres Merkmal des CARS-Kanals eine erhebliche Lipidansammlung. Während ähnliche Ansammlungen in einem entsprechenden Fasersondenbild leicht zu erkennen sind (Abb. 4e, rote Punkte), erschweren hier insgesamt eine geringere Signalintensität und ein geringerer Kontrast sowohl bei CARS als auch bei TPEF die Identifizierung von Krypten (unten links). Auf keinem der Bilder sind zelluläre oder subzelluläre Merkmale sichtbar. Im weiteren Sinne scheint die relative Homogenität der Schleimhaut bei niedrigen Auflösungen in CARS/TPEF-Bildern ein limitierender Faktor zu sein. Strukturen in der Submukosa und der Tunica muscularis, die einen starken SHG/TPEF liefern würden, sind sowohl im LSM- als auch im Fasersondenbild größtenteils unscharf. Um zu zeigen, dass dies eher auf die Morphochemie des Gewebes als auf die Sonde selbst zurückzuführen ist, wurde ein weiteres Fasersondenbild in einem Bereich aufgenommen, in dem sich die Schleimhaut aufgrund der mechanischen Beanspruchung aufgrund der Probenhandhabung ablöste (Abb. 4f), und zeigte die erwartete Schärfe Funktionen im TPEF- und SHG-Kanal. Insgesamt und mit den diskutierten Einschränkungen veranschaulicht Abb. 4 die Fähigkeit der vorgestellten multimodalen CARS/SHG/TPEF-Sonde, die Morphochemie von Hohlorganen zu visualisieren, was mit herkömmlichen mikroskopischen Techniken, z. B. Weißlichtendoskopie, nicht erreicht werden kann. Die multimodalen Bilder weisen eine hohe morphologische Konformität und Bildqualität auf, die in vielerlei Hinsicht mit Bildern vergleichbar ist, die mit einem Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurden. Nach der Bildgebung wurden an den Proben keine laserinduzierten Lichtschäden beobachtet.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Anwendbarkeit des vorgestellten Sondendesigns auf medizinisch relevante Proben, insbesondere einschließlich Massengewebe. Ebenso wichtig ist es jedoch, zukünftige Schritte aufzuzeigen, die noch notwendig sind, um einen anwendungsreifen Aufbau für klinische Anwendungsszenarien zu erreichen. Diese Schritte können in software- und hardwarebezogene Schritte unterteilt werden. Für die Hardware ist eine leicht zu reinigende Oberfläche am distalen Faserende erforderlich. Wie oben beschrieben, umfasst das aktuelle Design zur einfacheren Prototypenerstellung und mehr Vielseitigkeit in der Testphase kein festes Glasfenster und verlässt sich stattdessen auf ein Deckglas (170 µm), das auf der Probe platziert wird. Da dies die Bewertung eines handgehaltenen Betriebsverfahrens einschränkt und eine präzise Z-Steuerung durch eine mechanische Vorrichtung erfordert, wird die folgende Entwurfsiteration ein festes Fenster für den Betrieb unter Kontaktbedingungen enthalten. Auch die derzeit erreichbare Bildrate von etwa 2 fps (2 µs Verweilzeit, 256 × 256 px; Gerätelimit: ~ 8 fps im unidirektionalen Scanmodus) hängt mit den Betriebsbedingungen von Handgeräten zusammen, während die Bildqualität im Vergleich zu den Abbildungen gut bleibt. 1, 4 (siehe auch Abb. S3). Höhere, dh echte Videobildraten, die Bildverzerrungen während Messungen unter kontinuierlicher Sondenbewegung oder fehlende Überlappungen zwischen Bildern und daraus resultierende Unsicherheiten bei den relativen Bildpositionen vermeiden, sind wünschenswert und technisch durch die Verwendung eines Resonanzscanners erreichbar. In der aktuellen Implementierung wird die Scangeschwindigkeit immer noch durch die Laserausgangsleistung und die Detektorempfindlichkeit begrenzt, die beide adressierbar sind und nichts mit dem Sondendesign zu tun haben.

Andererseits könnte die Notwendigkeit von Mehrbildmessungen teilweise entfallen, wenn eine Faser verwendet wird, die ein größeres Sichtfeld bietet, wie beispielsweise die kommerziell erhältliche FIGH-100-1500N von Fujikura mit einem Durchmesser von 1,5 mm und anderen identische Parameter wie das in dieser Studie verwendete Faserbündel. Derzeit wird das Multiframe-Stitching als separater Nachbearbeitungsschritt durchgeführt und basiert auf den Positionsinformationen, die von einem Mikroskoptisch bereitgestellt werden. Es stehen optische Positionssensoren mit der nötigen Präzision zur Verfügung. Sie ließen sich vergleichsweise einfach in das Design integrieren, aber auch softwarebasiertes Online-Stitching ist mit moderner Hardware machbar geworden. Kommerzielle Lösungen43 berücksichtigen sogar Bewegungs- und Verzerrungsartefakte, wenn auch nicht ganz online. Ein solches Stitching erfordert eine echte Online-Bildrekonstruktion, auf die wir uns derzeit im Hinblick auf softwarebasierte Verbesserungen konzentrieren, da sie für das geplante Anwendungsszenario unbedingt erforderlich ist. Diese Probleme sind nicht grundlegender und technischer Natur und führen zu einem klaren Weg für zukünftige Entwicklungen hin zu einem praktischen Bildgebungsgerät für die spektrale Histopathologie in Echtzeit, das die klinischen Anforderungen berücksichtigt.

Diese Studie demonstrierte das Potenzial endoskopischer Multicore-Fasersonden mit nichtlinearer Bildgebung für klinische Anwendungen. Es wurde gezeigt, dass multimodale CARS/SHG/TPEF-Bilder von großen Gewebeproben, die mit einer solchen Sonde aufgenommen wurden, die Morphochemie solcher Proben mit Auflösungen detailliert beschreiben, die den Anforderungen des vorgeschlagenen Anwendungsszenarios genügen und gleichzeitig eine hervorragende Übereinstimmung mit Referenzbildern zeigen, die mit einem herkömmlichen LSM aufgenommen wurden. Darüber hinaus verbesserten das optimierte Design und die bessere Montagequalität im Vergleich zu einer früheren Implementierung32 die optische Leistung, was zu einer besseren Ausleuchtung und einer höheren Signalerfassungseffizienz führte. Obwohl wir anerkennen, dass es wahrscheinlich nicht den einzigen besten endoskopischen multimodalen nichtlinearen Bildgebungsansatz für alle Anwendungen geben wird und daher die technische Entwicklung für alle Implementierungen des Konzepts vorangetrieben werden sollte, machen unsere Ergebnisse Mehrkern-Fasersonden zu einer attraktiven Alternative für starre Sonden Endoskope, scannende Faserendoskope und miniaturisierte Galvo-Scanning-Systeme auf Spiegelbasis oder mikroelektromechanische Systeme für klinische Anwendungen. Konkret geht es bei Mehrkern-Fasersonden um ein einfacheres, widerstandsfähigeres und möglicherweise sichereres rein optisches Design ohne bewegliche oder stromführende Teile gegen einen größeren Durchmesser, eine geringere Laserleistungsübertragung und einen Auflösungsverlust aufgrund ihrer inhärent pixeligen Bilder .

Es zeigte sich, dass die Auswirkungen dieser Pixelisierung durch geeignete Bildverarbeitungsverfahren abgemildert werden können. Darüber hinaus erleichtert das in dieser Studie verwendete Verarbeitungsverfahren die Vergleichbarkeit verschiedener Bereiche im selben Bild und zwischen Bildern, die mit unterschiedlichen Sonden aufgenommen wurden, was für zukünftige Arbeiten relevant sein wird, insbesondere im Kontext einer klinischen Anwendung. Abschließend werden die nächsten technischen Schritte für zukünftige Entwicklungen hin zu praxistauglichen Bildgebungsgeräten für eine Reihe von Bereichen, darunter Dermatologie, Gastroenterologie, Neuro- oder Kopf-Hals-Chirurgie, diskutiert. In Kombination mit geeigneten Bildanalysealgorithmen kann das diskutierte Fasersondendesign einen schnellen, bequemen und markierungsfreien Ansatz für die spektrale Histopathologie etablieren, ohne dass Gewebe entfernt werden muss, wodurch potenzielle Risiken und Unannehmlichkeiten vermieden werden, die mit der klassischen histopathologischen und damit biopsiebasierten Untersuchung verbunden sind Ansätze.

Die native Großprobe des menschlichen Dickdarms und die Probe von menschlichem Kopf-Hals-Krebs wurden nach der Operation vom Universitätsklinikum Jena erhalten. Die Probanden gaben ihr Einverständnis und die Studie wurde von den Ethikkommissionen des Universitätsklinikums Jena genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Darmprobe vom Schwein (Sus scrofa Domestica) wurde kommerziell in einer örtlichen Metzgerei (Fleischerei Hönnger, Jena) erworben.

Digitale unterstützende Informationen sind online verfügbar und umfassen eine detaillierte Beschreibung aller Datenverarbeitungsschritte für die Bildrekonstruktion, einschließlich eines entsprechenden Flussdiagramms, einer Zusammenfassung aller relevanten Rekonstruktionsparameter, einer detaillierten Beschreibung des Rekonstruktionsalgorithmus und einer Übersicht über den Prozess für Core-to -Kernabstandsbestimmung, ein Bildqualitätsvergleich nach der Rekonstruktion für verschiedene ursprüngliche digitale Auflösungen, Details zur Signal-Rausch-Näherung, eine Diskussion verschiedener Depixelierungsansätze und eine Diskussion von Designüberlegungen bezüglich Kern-zu-Kern-Übersprechen und Auflösung. Darüber hinaus ist der Bildrekonstruktionsalgorithmus selbst als separate Datei verfügbar.

Originaldaten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Meyer, T., Schmitt, M., Dietzek, B. & Popp, J. Vorteile akkumulieren, Einschränkungen reduzieren: Multimodale nichtlineare Bildgebung in den biomedizinischen Wissenschaften – Die Synergie mehrerer Kontrastmechanismen. J. Biophotonics 6, 887–904 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Vogler, N., Heuke, S., Bocklitz, TW, Schmitt, M. & Popp, J. Multimodale bildgebende Spektroskopie von Gewebe. Annu. Rev. Anal. Chem. 8, 359–387 (2015).

Artikel Google Scholar

Yue, S., Slipchenko, MN & Cheng, J.-X. Multimodale nichtlineare optische Mikroskopie. Laser Photonics Rev. 5, 496–512 (2011).

Artikel ADS Google Scholar

Krafft, C., Schie, IW, Meyer, T., Schmitt, M. & Popp, J. Entwicklungen in der spontanen und kohärenten Raman-Streumikroskop-Bildgebung für biomedizinische Anwendungen. Chem. Soc. Rev. 45, 1819–1849 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Krafft, C. et al. Markierungsfreie molekulare Bildgebung biologischer Zellen und Gewebe durch lineare und nichtlineare Raman-spektroskopische Ansätze. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 4392–4430 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Heuke, S. et al. Multimodale nichtlineare Mikroskopie von Kopf-Hals-Karzinomen – Auf dem Weg zur Operation zur Unterstützung der Gefrierschnittanalyse. Kopf Hals J. Sci. Spez. 38, 1545–1552 (2016).

Artikel ADS Google Scholar

Chernavskaia, O. et al. Über die endoskopische Beurteilung bei entzündlichen Darmerkrankungen hinaus: Echtzeit-Histologie der Krankheitsaktivität durch nichtlineare multimodale Bildgebung. Wissenschaft. Rep. 6, 29239 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bocklitz, TW et al. Pseudo-HE-Bilder, abgeleitet aus der multimodalen CARS/TPEF/SHG-Bildgebung in Kombination mit Raman-Spektroskopie als pathologisches Screening-Tool. BMC Cancer 16, 1–11 (2016).

Artikel Google Scholar

Bojarski, C. et al. Innovative diagnostische Endoskopie bei entzündlichen Darmerkrankungen: Von der hochauflösenden zur molekularen Endoskopie. Vorderseite. Med. 8, 655404 (2021).

Artikel Google Scholar

Legare, F., Evans, CL, Ganikhanov, F. & Xie, XS Auf dem Weg zur CARS-Endoskopie. Opt. Express 14, 4427–4432 (2006).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Saar, BG, Johnston, RS, Freudiger, CW, Xie, XS & Seibel, EJ Kohärente Raman-Scanning-Faserendoskopie. Opt. Lette. 36, 2396–2398 (2011).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Myaing, MT, MacDonald, DJ & Li, XD Glasfaser-Scanning-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Endoskop. Opt. Lette. 31, 1076–1078 (2006).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Deladurantaye, P. et al. Fortschritte in der Entwicklung kontrastreicher CARS-Bildgebungsendoskope. Opt. Express 22, 25053–25064 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Savastano, LE et al. Multimodale laserbasierte Angioskopie zur strukturellen, chemischen und biologischen Bildgebung von Atherosklerose. Nat. Biomed. Ing. 1, 0023 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seibel, EJ, Brown, CM, Dominitz, JA & Kimmey, MB Scanning Single Fiber Endoscopy: Eine neue Plattformtechnologie für integrierte Laserbildgebung, Diagnose und zukünftige Therapien. Magen-Darm-Test. Endosz. Klin. N. Bin. 18, 467–478 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, CM, Engelbrecht, CJ, Soper, TD, Helmchen, F. & Seibel, EJ Scanning-Faserendoskopie mit hochflexiblen 1-mm-Katheterskopen für Weitfeld-Vollfarbbildgebung. J. Biophotonics 3, 385–407 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lombardini, A. et al. Hochauflösendes multimodales, flexibles, kohärentes Raman-Endoskop. Lichtwissenschaft. Appl. 7, 10 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pshenay-Severin, E. et al. Multimodale nichtlineare endomikroskopische Bildgebungssonde mit einer Doppelkern-Doppelmantelfaser und einem fokuskombinierenden mikrooptischen Konzept. Lichtwissenschaft. Appl. 10, 207 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, B. et al. Tragbares, miniaturisiertes, faserbasiertes, multimodales CARS-Exoskop. Opt. Express 21, 17161–17175 (2013).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Chen, X., Xu, X., McCormick, DT, Wong, K. & Wong, STC Multimodales nichtlineares Endomikroskopie-Sondendesign für hochauflösende, markierungsfreie intraoperative Bildgebung. Biomed. Opt. Express 6, 2283–2293 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Balu, M., Liu, G., Chen, Z., Tromberg, BJ & Potma, EO Faserbasierte Sonde für effiziente CARS-Bildgebung von Geweben. Opt. Express 18, 2380–2388 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Rivera, DR et al. Kompaktes und flexibles Raster-Scanning-Multiphotonen-Endoskop zur Abbildung von ungefärbtem Gewebe. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 108, 17598–17603 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zirak, P. et al. Eingeladener Artikel: Ein starres kohärentes Anti-Stokes-Raman-Streuungsendoskop mit hoher Auflösung und großem Sichtfeld. APL Photonics 3, 092409 (2018).

Artikel ADS Google Scholar

Hirose, K. et al. Kohärentes starres Anti-Stokes-Raman-Streuendoskop für robotergestützte Chirurgie. Biomed. Opt. Express 9, 387–396 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gmitro, AF & Aziz, D. Konfokale Mikroskopie durch ein faseroptisches Bildbündel. Opt. Lette. 18, 565–567 (1993).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Chen, X., Reichenbach, KL & Xu, C. Experimentelle und theoretische Analyse der Kern-zu-Kern-Kopplung bei der Faserbündel-Bildgebung. Opt. Express 16, 21598–21607 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ford, HD & Tatam, RP Charakterisierung optischer Faser-Bildgebungsbündel für die optische Kohärenztomographie mit Swept-Source. Appl. Opt. 50, 627–640 (2011).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Gobel, W., Kerr, JN, Nimmerjahn, A. & Helmchen, F. Miniaturisiertes Zwei-Photonen-Mikroskop basierend auf einem flexiblen kohärenten Faserbündel und einem Gradientenindex-Linsenobjektiv. Opt. Lette. 29, 2521–2523 (2004).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Hughes, M. & Yang, G.-Z. Konfokale Hochgeschwindigkeits-Zeilenscanning-Faserbündel-Fluoreszenz-Endomikroskopie für eine verbesserte Mosaikierung. Biomed. Opt. Express 6, 1241–1251 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Garofalakis, A. et al. Charakterisierung eines Multicore-Faser-Bildleiters für die nichtlineare endoskopische Bildgebung unter Verwendung von Zwei-Photonen-Fluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen. J. Biomed. Opt. 24, 1–12 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Lukic, A. et al. Fasersonde für nichtlineare Bildgebungsanwendungen. J. Biophotonics 9, 138–143 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lukic, A. et al. Endoskopische Fasersonde für die nichtlineare spektroskopische Bildgebung. Optica 4, 496–501 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Hamzeh, H., Lefort, C., Pain, F. & Abi Haidar, D. Optimierung und Charakterisierung der nichtlinearen Anregung und Sammlung durch eine Gradientenindexlinse für hochauflösende nichtlineare Endomikroskopie. Opt. Lette. 40, 808–811 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Meyer, T. et al. Ein kompakter Mikroskopaufbau für die multimodale nichtlineare Bildgebung in Kliniken und seine Anwendung in der Krankheitsdiagnostik. Analyst 138, 4048–4057 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Lai, C. et al. Entwurf und Test eines starren endomikroskopischen Systems für multimodale Bildgebung und Femtosekunden-Laserablation. J. Biomed. Opt. 28, 66004 (2023).

Artikel Google Scholar

Galli, R. et al. Intrinsischer Indikator für Lichtschäden bei der markierungsfreien Multiphotonenmikroskopie von Zellen und Geweben. PLoS ONE 9, e110295 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, T. et al. Multimodale nichtlineare mikroskopische Untersuchungen an Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich: Auf dem Weg zur intraoperativen Bildgebung. Kopf Hals 35, E280–E287 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Reichenbach, KL & Xu, C. Numerische Analyse der Lichtausbreitung in Bildfasern oder kohärenten Faserbündeln. Opt. Express 15, 2151–2165 (2007).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Krstić, RV Mikroskopische Anatomie des Menschen. Ein Atlas für Studierende der Medizin und Biologie, 2. Aufl. (Springer, 2010).

Google Scholar

Hortholary, T., Carrion, C., Chouzenoux, E., Pesquet, J.-C. & Lefort, C. Multiplex-Multiphotonen-Mikroskopie und Rechenstrategie für die biomedizinische Bildgebung. Mikrosk. Res. Technik. 84, 1553–1562 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ducourthial, G. et al. Entwicklung eines flexiblen Echtzeit-Multiphotonen-Mikroendoskops für die markierungsfreie Bildgebung bei einem lebenden Tier. Wissenschaft. Rep. 5, 18303 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shinde, A. & Matham, MV Pixelatentfernung in einem Bildfasersonden-Endoskop mit Methoden zur Entfernung von Kammstrukturen. J. Med. Bildgebende Gesundheitsinformationen. 4, 203–211 (2014).

Artikel Google Scholar

Vercauteren, T., Perchant, A., Malandain, G., Pennec, X. & Ayache, N. Robuste Mosaikierung mit Korrektur von Bewegungsverzerrungen und Gewebedeformationen für die In-vivo-Fasermikroskopie. Med. Bild Anal. 10, 673–692 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Finanzielle Unterstützung des Ministeriums für Wissenschaft und Bildung (BMBF) im Rahmen des Projekts „Fiber Health Probe“ (FKZ: 13N1225, 3N12526), der Carl-Zeiss-Stiftung und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, BO 4700/1-1 und PO563). /30-1) ist hoch anerkannt. Adrian Press würdigt außerdem das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung am Universitätsklinikum Jena (AMSP 05). Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch den Sonderforschungsbereich PolyTarget (SFB 1278 – Projekte C01, B08, Projekt-ID 316213987), gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Dieses Projekt wurde vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union unter der Fördernummer 101016923 gefördert. Wir danken Aleksandar Lukic für die Durchführung von Pilotversuchen, den GRINTECH-Mitarbeitern für die Montage des Sondenkopfs und Tatiana Kirchberger-Tolstik für die Vorbereitung von und Hilfe bei der Interpretation von H&E-Flecken.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Leibniz-Institut für Photonische Technologien (Leibniz-IPHT), Mitglied der Leibniz-Gesundheitstechnologien, Mitglied des Leibniz-Zentrums für Photonik in der Infektionsforschung (LPI), Postfach 100239, 07702, Jena, Deutschland

Hyeonsoo Bae, Marko Rodewald, Tobias Meyer-Zedler und Jürgen Popp

Institut für Physikalische Chemie und Abbe-Zentrum für Photonik, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4, 07743, Jena, Deutschland

Hyeonsoo Bae, Marko Rodewald, Tobias Meyer-Zedler, Thomas W. Bocklitz, Michael Schmitt und Jürgen Popp

Center for Sepsis Control and Care (CSCC), Universitätsklinikum Jena, Erlanger Allee 101, 07747, Jena, Deutschland

Hyeonsoo Bae, Adrian T. Press & Michael Bauer

GRINTECH GmbH, Schillerstraße 1, 07745, Jena, Germany

Gregor Matz & Bernhard Messerschmidt

Abteilung für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Universitätsklinikum Jena, Am Klinikum 1, 07747, Jena, Deutschland

Adrian T. Press & Michael Bauer

Medizinische Fakultät, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Kastanienstr. 1, 07747, Jena, Deutschland

Adrian T. Press

Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Universitätsklinikum Jena, Am Klinikum 1, 07747, Jena, Deutschland

Orlando Guntinas-Lichius

Abteilung für Innere Medizin IV, Universitätsklinikum Jena, Am Klinikum 1, 07747, Jena, Deutschland

Andreas Stallmach

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Originalmanuskripterstellung: HB, MRTM-Z.; Aufbau Mikroskop: HB; Bildrekonstruktion und Datenanalyse: MR; optisches Design des Sondenkopfes: GM, BM; Probenvorbereitung und biomedizinische Interpretation der Ergebnisse: ATP, MB, OG-L., AS; Studiendesign, Projektkoordination, Betreuung, Manuskriptrevision: TM-Z., MS, BM, JP; Unterstützung und Diskussion von Bildrekonstruktionsalgorithmen: TB; Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts genehmigt. HB und MR trugen gleichermaßen zu dieser Studie bei.

Korrespondenz mit Jürgen Popp.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Bae, H., Rodewald, M., Meyer-Zedler, T. et al. Machbarkeitsstudien der multimodalen nichtlinearen Endoskopie unter Verwendung von Multicore-Faserbündeln für das Fernscannen von Gewebeschnitten bis hin zu großen Organen. Sci Rep 13, 13779 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40944-6

Zitat herunterladen

Eingegangen: 08. Juni 2023

Angenommen: 18. August 2023

Veröffentlicht: 23. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40944-6

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.