Benchmarking von Kraftfeldern zur Charakterisierung des intrinsisch ungeordneten R2

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14226 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Intrinsisch ungeordnete Proteine ​​(IDPs) spielen bei zahlreichen Krankheiten wie Alzheimer und ALS eine entscheidende Rolle, indem sie irreversible Amyloidfibrillen bilden. Die Wirksamkeit von Kraftfeldern (FFs), die für globuläre Proteine ​​entwickelt wurden, und ihrer modifizierten Versionen für IDPs variiert je nach spezifischem Protein. Diese Studie bewertet 13 FFs, darunter AMBER und CHARMM, durch Simulation der R2-Region der FUS-LC-Domäne (R2-FUS-LC-Region), einem IDP, der an ALS beteiligt ist. Aufgrund der Flexibilität der Region zeigen wir, dass die Verwendung mehrerer Maßnahmen zur Bewertung der lokalen und globalen Konformationen und deren Kombination zu einem Endergebnis für eine umfassende Bewertung von Kraftfeldern wichtig sind. Die Ergebnisse legen nahe, dass c36m2021s3p mit mTIP3p-Wassermodell das ausgewogenste FF ist und in der Lage ist, verschiedene Konformationen zu erzeugen, die mit bekannten kompatibel sind. Darüber hinaus ist das mTIP3P-Wassermodell rechnerisch effizienter als die hochrangigen AMBER-FFs mit Wassermodellen mit vier Standorten. Die Auswertung zeigt auch, dass AMBER-FFs im Vergleich zu CHARMM-FFs tendenziell kompaktere Konformationen erzeugen, aber auch mehr nicht-native Kontakte. Die am besten bewerteten AMBER- und CHARMM-FFs können Intra-Peptid-Kontakte reproduzieren, weisen jedoch bei Inter-Peptid-Kontakten eine schlechtere Leistung auf, was darauf hindeutet, dass es Raum für Verbesserungen gibt.

Intrinsisch ungeordnete Proteine ​​(IDPs) sind Proteine, die je nach Umgebung und ihren Bindungspartnern unterschiedliche Konformationen annehmen können1. Einige IDPs können sich selbst aggregieren und Amyloidfibrillen bilden, die die Kreuz-β-Struktur annehmen2. Die Kreuz-β-Struktur besteht aus Beta-Strang-Proteinen/Peptiden, die entlang der Länge der Faser gestapelt sind und lange Beta-Faltblätter bilden, die Protofibrillen genannt werden. Schließlich bilden Komplexe von Protofibrillen Amyloidfibrillen3.

Amyloidfibrillen werden mit Krankheiten4,5 wie Alzheimer, Parkinson, Typ-II-Diabetes, Amyotropher Lateralsklerose (ALS)4,6,7 und anderen in Verbindung gebracht. ALS ist eine seltene neurodegenerative Erkrankung8,9, bei der in 50 % der Fälle der Tod innerhalb von drei Jahren nach der ersten klinischen Manifestation eintritt10. Bei ALS-Patienten wurden Aminosäuremutationen in der Low-Complexity (LC)-Region des Fused in Sarcoma (FUS)-Proteins gefunden11,12,13,14,15,16. In der mutierten FUS-LC-Region wurde eine irreversible Amyloidfibrillenaggregation beobachtet, während im Wildtyp reversible Fibrillen beobachtet werden11,16,17.

Das menschliche FUS-Protein (526 Reste) ist am Spleißen und Transkriptieren von mRNA beteiligt. Der FUS-LC-Kern33–96 ist an der Bildung von Amyloidfibrillen11,17,18,19,20,21 beteiligt und enthält vier Wiederholungsmotive (R1-R2-R3-R4)17 (Abb. S1, violette Kästchen). Innerhalb von R1/R2 sind die Tandemmotive [S/G]Y[S/G] an der Bildung reversibler Amyloidfibrillenkerne (RAC)17 beteiligt (Abb. 1 und Abb. S1). Es ist bekannt, dass die R2-Region für die Fibrillenbildung wichtiger ist als R122,23. Die Strukturen des FUS-LC-Kerns33–9616,24 (Abb. 1) zeigen, dass die R2-Region nur wenige Fernkontakte mit dem Rest der LC-Kerndomäne aufweist (Abb. S2). Daher ist die Region R2-FUS-LC50–65 ein guter Kandidat für die Untersuchung von Amyloidflimmern.

Domänenorganisation des Volllängen-Fused-in-Sarcoma-Proteins (FUS). Die N-terminale Domäne niedriger Komplexität (LC) von FUS (Reste 1–214) enthält eine QGSY-reiche Prionen-ähnliche Domäne (1–165, violetter Kasten) und eine Gly-reiche Region (166–214, rosa Kasten). Innerhalb der QGSY-reichen Domäne gibt es vier Wiederholungsmotive (R1–R2–R3–R4). Innerhalb von R2 (R2-FUS-LC-Region) gibt es einen reversiblen Amyloidfibrillenkern (RAC 2), der an der Fibrillenbildung beteiligt ist. Wir verwenden nur die R2-FUS-LC-Region, um das FUS-Fibrillieren zu untersuchen. Im oberen roten Quadrat befinden sich zwei verschiedene experimentell gelöste Konformationen der R2-FUS-LC-Region. Links sechs Vertreter der R2-FUS-LC-Region, ausgewählt aus den 20 Modellen der NMR-Struktur (PDB-ID: 5W3N16, „U-förmig“). Rechts das Kryo-EM-Modell von PDB ID: 7VQQ24, „L-förmig“. Die Abbildung wurde mit Microsoft PowerPoint und VMD v1.9.325 (https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) erstellt.

Unser derzeitiges Verständnis des Mechanismus der Amyloidfibrillenaggregation ist dürftig. Darüber hinaus wurde berichtet, dass einige der vorübergehenden Zwischenstrukturen von Binnenvertriebenen toxisch sind26. Ein Ansatz zur Untersuchung der Fibrillenbildung und ihrer Zwischenprodukte ist die Durchführung atomarer Molekulardynamiksimulationen (MD). Amyloid-β-Peptide, die bei Alzheimer die Amyloidfibrillen bilden, werden häufig mithilfe von MD-Simulationen untersucht27,28,29.

Allerdings weisen experimentelle Daten und Simulationsergebnisse häufig Diskrepanzen auf27,30. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass die All-Atom-Kraftfelder (FFs) wie AMBER, CHARMM31,32, OPLS-AA33,34 und GROMOS35,36 entwickelt wurden, um die Eigenschaften stabiler globulärer Proteine ​​zu reproduzieren. Im Gegensatz dazu nehmen IDPs mehrere instabile Konformationen an, bei denen unpolare Reste häufig dem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Mehrere Forschungsgruppen haben FFs optimiert, um experimentelle Daten besser zu reproduzieren27,37,38,39,40,41,42 [Tabelle S1 und Sup. Die Info. Abschnitt Benchmark von Kraftfeldern (FFs) und Wassermodellen (WMs)]. Es ist unklar, ob diese modifizierten FFs auf alle Binnenvertriebenen übertragbar sind. Beachten Sie, dass wir uns im gesamten Text, wenn wir uns auf die FFs beziehen, auf das Ergebnis oder die Eigenschaften beziehen, die bei der Durchführung von Simulationen mit dem jeweiligen FF beobachtet wurden.

In dieser Arbeit wenden wir weit verbreitete MD-Kraftfelder zur Untersuchung von IDPs auf den R2-FUS-LC an (Abb. 1 und Abb. S1), um zu bewerten, ob sie Konformationsensembles von Fibrillen untersuchen können, die mit experimentellen Daten übereinstimmen. Wir wählen zehn FFs und Wassermodelle (WMs) aus, die kürzlich für Binnenvertriebene entwickelt wurden. Zum Vergleich haben wir c27s3p-, a99sb4pew- und a14sb3p-FFs einbezogen, die zur Entwicklung einiger IDP-FFs verwendet wurden. Wir bewerten diese dreizehn FFs anhand von drei Kriterien: der Kompaktheit der Fibrillen, den Intrapeptidkontakten im Cross-β-Zustand und der Neigung zur Sekundärstruktur. Überraschenderweise gelingt es den meisten FFs nicht, die experimentellen Daten zu reproduzieren. Unsere Bewertungsmethode legt nahe, dass CHARMM36m2021 FF mit dem mTIP3P-Wassermodell am besten für die Untersuchung der R2-FUS-LC-Fibrillation geeignet ist.

Wir führten sechs MD-Simulationen mit einer Dauer von jeweils 500 ns und einer Gesamtdauer von 3 μs mit jeweils dreizehn FFs durch (Tabelle S1). Um die FFs gegen die reversible Amyloidfibrillen-R2-FUS-LC-Region (Trimer aus 16 Restpeptiden) zu bewerten, verwendeten wir drei Maße: Gyrationsradius (Rg), Sekundärstrukturneigung (SSP) und Intra-Peptid-Kontaktkarte. Rg misst die globale Kompaktheit/Ausdehnung des Trimers und einzelner Peptide (Abb. S3). SSP und Intra-Peptid-Kontaktkarte betreffen beide die lokalen Kontaktdetails der R2-FUS-LC-Region. Wir haben die dreizehn FFs auf der Grundlage einer kombinierten Bewertung eingestuft, die aus diesen drei Kennzahlen abgeleitet wurde (Tabelle 1, Endbewertung).

Basierend auf dem Endergebnis (Tabelle 1) können die dreizehn FFs in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden: oberste („*“), mittlere („•“) und unterste („#“) Ranggruppen entsprechend der Reihenfolge der Ergebnisse.

FFs in der „Top“-Gruppe haben für alle Maßnahmen mittlere (0,3–0,7) bis hohe (> 0,7) Werte. FFs in der „untersten“ Gruppe wie c27s3p und a03ws weisen in allen drei Messungen niedrige Werte (< 0,3) auf. Allerdings zeichnet sich a14sb3p durch relativ gute Werte für SSP und Kontaktkarte, aber einen niedrigen Rg-Wert aus. Andererseits hat c36m3pm den besten Intrapeptid-Kontaktkartenwert, aber einen schlechten SSP-Wert. FFs in der „mittleren“ Ranggruppe weisen tendenziell niedrige Werte für mindestens eine der drei Messgrößen auf, weisen jedoch bei den übrigen eine mittlere Zustimmung auf. Einzelheiten zu den drei Maßnahmen werden in den folgenden Abschnitten erläutert.

Der Rg-Score misst die Fähigkeit der FFs, sowohl kompakte als auch ungefaltete Zustände der R2-FUS-LC-Region abzutasten. Die Referenzdaten für den gefalteten Kreuz-β-Strukturzustand umfassen zwei unterschiedliche Konformationen der R2-FUS-LC-Region: „U-förmige“ Konformation (PDB: 5W3N16) und „L-förmige“ Konformation (PDB: 7VQQ24), wie gezeigt in Abb. 1. Beide Konformationen bilden eine Kreuz-β-Struktur. Zwanzig U-förmige Modelle mit unterschiedlichen Schleifenkonformationen wurden durch NMR mit einem durchschnittlichen Rg von 10,0 Å (Trimer von R2-FUS-LC) und der weniger kompakten (Rg: 14,4 Å) L-förmigen Konformation (Trimer von R2-FUS-LC) gelöst. LC) wurde durch Kryo-EM gelöst. Die Reversibilität der Kreuz-β-Struktur11,17 legt nahe, dass die R2-FUS-LC-Region den entfalteten Zustand annehmen könnte. Um den Rg des entfalteten Zustands abzuschätzen, verwendeten wir Florys Random-Coil-Polymer-Modell mit optimierten Parametern für IDPs43. Wir haben somit drei verschiedene Maße von Rg: L-förmiges, U-förmiges und ungefaltetes Rg.

Die Verteilungen von Rg für Schnappschüsse aus den Simulationsdaten sind in Abb. 2 und Abb. S4 dargestellt. Um zu beurteilen, wie häufig die FFs Konformationen erzeugen können, die den Referenzstrukturen hinsichtlich Rg sehr ähneln, haben wir die Rg-Verteilungen an zwei Gauß-Verteilungen angepasst. Der Abstand vom i-ten Mittelwert zum k-ten Referenz-Rg wurde als absolute Anzahl der Standardabweichungen (\({\text{Z-Score}}_{FF,k,i}\)) des i berechnet 'th Gauß. Der niedrigste \({\text{Z-Score}}_{FF,k,i}\) wurde ausgewählt, invertiert und durch lineare Skalierung von 0,00001 auf 1,0 normalisiert (Tabelle 2). Der endgültige Rg-Score wurde berechnet, indem die drei normalisierten Scores multipliziert und auf die gleiche Weise neu skaliert wurden (Tabelle 2).

Verteilung des Trägheitsradius (Rg). Die beiden bestplatzierten FFs für die endgültige Rg-Wertung (Tabelle 2) sind C36m2021s3p (rot) und c36ms3p (rosa). Diese FFs können kompakte und erweiterte Konformationen erzeugen, die sowohl die U- als auch die L-förmigen Rgs abdecken. Allerdings erfasste a14sb3p (grün) nur kompakte Konformationen (im Einschub als vergrößerte Ansicht dargestellt). Andererseits erzeugte c36m3pm (hellgrün) erweiterte Konformationen. Beide FFs rangieren ganz unten. Die Abbildung wurde mit Matplotlib v3.544 (https://matplotlib.org/) erstellt.

Die dreizehn FFs können in drei Gruppen unterteilt werden. Beim Vergleich der Rangfolge der Endpunktzahl (Tabelle 1) und der Rg-Endpunktzahl (Tabelle 2) sind die vier besten FFs (c36m2021s3p, a99sb4pew, a19sbopc und c36ms3p) gleich, obwohl die Reihenfolge leicht unterschiedlich ist.

Bei der Analyse von Tabelle 2 haben wir zwei verschiedene Arten von FFs unter den ersten vier identifiziert. Der erste Typ umfasst c36m2021s3p und a19sbopc, die beide über die drei Referenz-Rgs hinweg eine konstante Leistung zeigten. Andererseits besteht der zweite Typ aus c36ms3p und a99sb4pew, die eine Präferenz für flexible bzw. kompakte Konformationen zeigten. Wir beobachteten auch eine Tendenz zum U-förmigen Rg in a99sb4pew, a99sbCufix3p und a14sb3p (Abb. S4), während c36m2021s3pm und c36m3pm (Abb. S4) das ungefaltete Rg bevorzugten. Es ist jedoch anzumerken, dass der endgültige Rg-Rang dieser FFs umgekehrt mit der Stärke ihrer Verzerrung der abgetasteten Konformationen korreliert. Dies liegt daran, dass unser Bewertungsschema FFs bestraft, die nur zu einem bestimmten Referenz-Rg gut passen, für die anderen jedoch eine schlechte Leistung erbringen. Infolgedessen sind die beiden FFs mit der schlechtesten Leistung c36m3pm und a14sb3p (Abb. 2).

Insgesamt neigen CHARMM-FFs dazu, ausgedehntere Konformationen zu erzeugen als AMBER-FFs (Abb. S3 und S4), mit Ausnahme von a03ws.

Rg ist ein Maß für die globale Kompaktheit einer Konformation, eignet sich jedoch nicht zur Beurteilung der Details der Konformation. Um die untersuchten Konformationen detaillierter zu beurteilen, haben wir in den nächsten Abschnitten zwei Maße eingeführt: die Intra-Peptid-Kontaktkarte und die Sekundärstrukturneigung (SSP). Diese Maßnahmen bewerten die Wechselwirkungen innerhalb des Peptids.

Die U-förmigen und L-förmigen Konformationen enthalten 20 bzw. 15 Intrapeptidkontakte (Abb. 3). In der L-förmigen Konformation wurden innerhalb eines 5 Å-Grenzwerts keine Kontakte zwischen den Resten j und > j + 5 (Kontakte mittlerer Entfernung) beobachtet. In der U-förmigen Konformation finden sich jedoch Kontakte mittlerer Entfernung zwischen Tyr50–Tyr55, Tyr50–Thr64, Tyr50–Gly65, Tyr55–Asn63 und Ser57–Ser61. Daher werden wir zur Bewertung der FFs nur die U-förmige Konformation berücksichtigen.

Intrapeptid-Kontaktkarte für U-förmige (links, PDB-ID: 5W3N) und L-förmige (rechts, PDB-ID: 7VQQ) Konformationen mit einem Cutoff von 5 Å. Die Kontakttypen sind farblich gekennzeichnet, wobei „Sc“ der Seitenkette und „Bb“ dem Rückgrat entspricht. In beiden Konformationen finden die meisten Kontakte innerhalb von ± 3 Resten statt. Die U-förmige Konformation weist einige Kontakte mittlerer Entfernung auf, wohingegen die L-förmige Konformation keine Kontakte mittlerer Entfernung aufweist. Die Abbildung wurde mit Matplotlib v3.544 (https://matplotlib.org/) erstellt.

Für jede der dreizehn FF-MD-Simulationen haben wir die durchschnittlichen Intra-Peptid-Kontakte für die Trimer über alle Schnappschüsse hinweg berechnet. Die Kontakte der FFs und der U-förmigen Konformation wurden mithilfe des Matthews-Korrelationskoeffizienten (MCC)45-Scores verglichen (Tabelle 3). Der MCC-Score reicht von −1 bis 1, wobei ein Wert von 1 eine perfekte Korrelation, −1 eine perfekte Antikorrelation und 0 keine Korrelation anzeigt. Die MCC-Bewertung bestraft falsche Vorhersagen, was bedeutet, dass FFs, die die meisten nativen Kontakte vorhergesagt haben (True Positives, TP), wie a99sb4pew, c27s3p und a14sb3p (Tabelle S2), nicht unbedingt die FFs mit der höchsten Bewertung sind (Tabelle 3). Der Normalisierungsprozess wurde auf ähnliche Weise wie im vorherigen Abschnitt beschrieben durchgeführt.

In der Kontaktkarten-Score-Rangliste (Tabelle 3) gibt es einige überraschende Ergebnisse. Obwohl die FFs c36m2021s3pm und c36m3pm aufgrund der Endpunktzahl als Schlusslicht eingestuft wurden (Tabelle 1), lagen sie in der Kontaktkartenpunktzahl an der Spitze. c36m2021s3p hingegen, das die höchste Endpunktzahl aufwies, belegte nur den 4. Platz. Darüber hinaus wurde a99sbCufix3p am Ende platziert, obwohl es im Endergebnis einen mittleren Rang belegte.

Bei der Untersuchung der Verwirrungsmatrizen für die vier FFs (Tabelle 4 und Tabelle S2) haben wir einige Beobachtungen gemacht. Erstens neigen c36m2021s3pm, c36m3pm und c36m2021s3p, die die höchsten Werte für ungefaltetes Rg aufweisen, dazu, ausgedehntere Konformationen zu bevorzugen. Dies ist daran zu erkennen, dass < 20 % der Restpaare in Kontakt stehen. Im Gegensatz dazu bevorzugt a99sbCufix3p kompaktere Konformationen, wobei 23,16 % der Restpaare in Kontakt stehen.

Es ist erwähnenswert, dass CHARMM-FFs mit erweiterten Konformationen zwar weniger Gesamtkontakte aufweisen (Tabelle 4, Total Pred. True), aber auch deutlich weniger nicht-native Kontakte aufweisen (Tabelle 4, fett). Umgekehrt hat a99sbCufix3p insgesamt mehr Kontakte, aber ein größerer Anteil dieser Kontakte ist nicht-nativ (Tabelle 4). Nach dem Ausschluss dieser vier FFs wurde festgestellt, dass die Kontaktkarten-Score-Rangliste der verbleibenden FFs (Tabelle 3) mit der endgültigen Score-Rangliste übereinstimmt (Tabelle 1).

Die L-förmige Konformation besteht hauptsächlich aus β-Strängen, bildet jedoch keine β-Faltblätter innerhalb des Peptids. Daher können seine Konformationen nicht aus den Kontaktkarten innerhalb des Peptids bestimmt werden. Dies motiviert uns, im folgenden Abschnitt die Sekundärstrukturneigung (SSP) dieser FFs zu bewerten.

In jedem Schnappschuss wird das Dictionary of Protein Secondary Structure (DSSP)46,47 verwendet, um jedem Rest den Sekundärstrukturtyp (α-Helix, β-Strang oder Knäuel) zuzuordnen. Für jeden Rest definieren wir seine SSP/Wahrscheinlichkeit für alle Sekundärstrukturtypen, indem wir die Anzahl der Vorkommen in allen Snapshots zählen und diese durch die Gesamtzahl der Snapshots dividieren. Um den SSP der FFs für die R2-FUS-LC-Region zu bewerten, definieren wir den SSP-Score als die logarithmische Wahrscheinlichkeit der Beobachtung der experimentellen (U-förmigen und L-förmigen) Sekundärstrukturen unter Berücksichtigung der SSP-Wahrscheinlichkeitsverteilungen, die aus den Simulationsschnappschüssen erhalten wurden ( Details unter Methoden). Die Normalisierung wurde auf ähnliche Weise wie zuvor beschrieben durchgeführt.

In Tabelle 5 sehen wir, dass der SSP-Score für a14sb3p und a99sbCufix3p höher ist, für c36ms3p und c36m2021s3pm jedoch niedriger im Vergleich zu ihrem endgültigen Rang. Die FFs mit höheren SSP-Werten neigen dazu, kompaktere Konformationen zu erzeugen, wie ihre Rg-Werte belegen (Tabelle 2). Umgekehrt neigen die FFs mit niedrigeren Rängen dazu, ausgedehntere Konformationen zu bevorzugen. Dies legt nahe, dass die Bildung nativer Sekundärstrukturen für die Entwicklung kompakter Fibrillen notwendig ist.

Die a03ws- und c27s3p-FFs, die die niedrigsten SSP-Werte aufweisen, zeigen eine starke Tendenz, Konformationen mit α-Helices um das RAC2-Motiv zu erzeugen (Abb. 4). Allerdings bildet dieser Bereich sowohl in der L-förmigen24 als auch in der U-förmigen16 Konformation β-Stränge. Daten zur chemischen NMR-Verschiebung bestätigen auch das Fehlen von α-Helices in der R2-FUS-LC-Region16,17,18,22,48.

α-Helix-Sekundärstrukturneigung (SSP). Experimentelle Daten von Murray et al. weisen darauf hin, dass innerhalb der 16 Reste keine α-Helix-Neigung vorliegt. Es werden nur FFs mit einer α-Helix-Neigung pro Rest von mehr als 0,1 angezeigt. Alle FFs, mit Ausnahme von a14sb3p (2. Rang), liegen am unteren Ende des SSP-Rangs (Tabelle 5). Trotz einer geringen Menge an α-Helix-SSP weist a14sb3p aufgrund seines hohen β-Strang-SSP einen hohen SSP-Rang auf (Abb. S5). Die Abbildung wurde mit Matplotlib v3.544 (https://matplotlib.org/) erstellt.

Unsere Beobachtung zeigt, dass AMBER-FFs, insbesondere a14sb3p und a99sbCufix3p, kompaktere Konformationen erzeugen als die CHARMM-FFs c36ms3p und c36m2021s3pm, die tendenziell ausgedehntere Konformationen erzeugen. FFs mit ausgedehnteren Konformationen können die Eigenschaften von U- und L-förmigen Konformationen besser reproduzieren als FFs, die kompaktere Konformationen erzeugen, die nur zu einer dieser Konformationen gut passen.

Sowohl AMBER- als auch CHARMM-FFs reproduzieren die für die Bildung von Fibrillen erforderlichen Wechselwirkungen zwischen Peptiden nicht ordnungsgemäß (Tabelle S3), obwohl AMBER-FFs relativ besser abschneiden als CHARMM-FFs. Die Präferenz von CHARMM-FFs für erweiterte Konformationen erstreckt sich auch auf ihre Wechselwirkungen zwischen Peptiden: Die Peptide bleiben etwa die Hälfte der Zeit als Dimere oder Monomere im Gegensatz zu AMBER-FFs (außer a03ws), die hauptsächlich als Trimer verbleiben (Tabelle S4). Die Interpeptid-Interaktionswerte wurden nicht in den Endwert einbezogen, da alle FFs eine schlechte Leistung erbringen und das Endergebnis nur verfälschen würden.

In unserer Studie könnte die begrenzte Abtastzeit (nur 3 µs) zu der beobachteten schlechten Leistung beigetragen haben. Die Fibrillenbildung erfolgt typischerweise über einen viel längeren Zeitraum von Stunden bis Tagen16,24. Um dieses Problem zu lindern, aber nicht zu lösen, haben wir die Peptidkonzentration von 0,16 mM (wie bei der NMR-Strukturbestimmung16 verwendet) auf 10 mM erhöht, indem wir das Verhältnis der Anzahl der Peptide zur Anzahl der Wassermoleküle verringert haben (mehr Wasser hinzufügen) und initiiert Simulationen aus der U-förmigen Konformation in Fibrillenform. Eine höhere Konzentration an FUS-Peptiden erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass diese Peptide miteinander interagieren und Fibrillen bilden. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass die meisten FF-Simulationen innerhalb von 300 ns nahezu konvergierten, indem wir die durchschnittlichen Rg-Werte über die Zeit überwachten (Abb. S6).

Möglicherweise ist das gewählte Fragment nicht in der Lage, selbstständig Fibrillen zu bilden. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, analysierten wir die Intra-Protein-Wechselwirkungen der LC-Domäne voller Länge (Reste 1–214). Die Kontaktkarten zeigen, dass es begrenzte Fernkontakte zwischen den R2-FUS-LC-Regionen und dem Rest des Proteins in den U/L-förmigen Konformationen gibt (Abb. S2), was darauf hinweist, dass die R2-FUS-LC-Region funktioniert als eigenständige Domäne innerhalb der größeren LC-Domäne, zumindest in der Fibrille.

Unsere Studie bestätigt frühere Untersuchungen von Lao et al. die das a99sbildn4pd mit TIP3P-Wassermodell anstelle von TIP4PD verwendeten, um eine längere FUS-Region zu simulieren, die die R2-FUS-LC-Region umfasste23. Unsere Ergebnisse zeigen ähnliche Kontaktkartenmuster wie ihre Studie, und wir beobachteten auch eine Neigung von ~ 5 % zu α-Helices, was mit ihrer Arbeit übereinstimmt. Wir stellten jedoch eine Diskrepanz in der β-Strang-Neigung zwischen unserer und ihrer Studie fest, wobei in ihrer Studie eine viel höhere β-Strang-Neigung festgestellt wurde als bei uns (Abb. S5). Dieser Unterschied kann auf die Länge des in jeder Studie verwendeten Peptids zurückgeführt werden, wobei in ihrer Studie eine Peptidlänge von 60 Resten verwendet wurde, verglichen mit der Länge unserer Studie von 16 Resten.

Unsere Ergebnisse stimmen auch mit anderen Studien zu Amyloid-β-Proteinen überein, bei denen verschiedene FFs unterschiedliche Konformationsensembles erzeugten, von denen einige mit der Fibrillenaggregation kompatibel sind42,49,50. Beispielsweise haben Pedersen et al. fanden heraus, dass a19sbopc kompaktere Konformationen erzeugt und mehr β-Stränge bildet als a99disp49, während Samantray et al. zeigten, dass c36ms3p vielversprechende Ergebnisse für die Probenahme und Bildung von Konformationsensembles mit zufälligen Spulen- und β-Strang-Strukturen lieferte 50 . Schließlich stimmt unsere endgültige Bewertung mit den Ergebnissen des Amyloid-β-Peptids (Aβ40) von Robustelli et al. überein. Dies zeigt, dass c36ms3p das Beste ist, mit Ausnahme von c22s3p, das in unserem Ranking hinter a99disp und a99sbildn4pd zurückblieb27. Darüber hinaus beobachteten sie auch, dass c22s3p und a03ws die α-Helix-Neigung überschätzen (Abb. 4).

Darüber hinaus stimmen unsere Ergebnisse mit denen von Piana et al. überein, die Wassermodelle mit drei und vier Standorten mit AMBER- und CHARMM-FFs42 getestet haben. Bei Verwendung des TIP3P-Wassermodells (3 Standorte) erwiesen sich CHARMM-FFs als flexibler als AMBER-FFs, und bei Verwendung von 4-Standort-Wassermodellen wurden AMBER-FFs mit Ausnahme von a99sb4pew deutlich flexibler (Abb. S4).

In dieser Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von Kraftfeldern, die für globuläre Proteine ​​entwickelt wurden, und deren modifizierte Versionen für intrinsisch ungeordnete Proteine. Wir fanden heraus, dass diese Kraftfelder mit ihren angepassten Wassermodellen unterschiedliche Konformationsensembles erzeugen. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Verwendung mehrerer Maßnahmen für eine umfassende Bewertung von Kraftfeldern aufgrund der intrinsischen Flexibilität dieses Systems, das β-Strang-Fibrillen bilden und zufällig gewundene Konformationen annehmen kann.

Unsere Auswertung von dreizehn Kraftfeldern aus den CHARMM- und AMBER-Familien ergab, dass c36m2021s3p im Hinblick auf die drei verwendeten Maße am ausgewogensten ist. Dieses Kraftfeld kann verschiedene Konformationen erzeugen, die mit U/L-förmigen Konformationen kompatibel sind, und es zeigte eine gute Übereinstimmung hinsichtlich der SSP- und Intrapeptid-Kontaktkarte. Darüber hinaus ist sein mTIP3P-Wassermodell rechenintensiv als die hochrangigen AMBER-FFs mit Wassermodellen mit vier Standorten.

Mehrere 3D-Strukturen der FUS-LC-Domäne wurden durch Röntgenkristallographie17,51, Elektronenkristallographie17,52, Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)24 und NMR16 gelöst. Die Einzelheiten der Strukturen sind in Tabelle S5 aufgeführt.

Von den 20 U-förmigen NMR-Modellen (PDB-ID: 5W3N16) wurde die Region der Reste 50–65 (R2-FUS-LC-Region, Abb. 1, rotes Quadrat) der ersten drei Ketten (Trimer) verwendet. Die 20 Strukturen wurden mithilfe des GROMACS-Tools gmx Cluster53 mit einem RMSD-Grenzwert von 1,7 Å (nur Cα) in sechs Gruppen gruppiert. Die sechs repräsentativen Strukturen wurden verwendet, um sechs unabhängige MD-Simulationen durchzuführen.

All-Atom-MD-Simulationen wurden mit GROMACS 2020.454,55 durchgeführt. Die sechs Anfangskonformationen von R2-FUS-LC (663 Atome) wurden in einer kubischen Box von 80 × 80 × 80 Å3 solvatisiert. Um die Bedingungen des NMR-Experiments22 zu reproduzieren, wurden 137 mM NaCl-Ionen hinzugefügt (~ 17.000 Wassermoleküle). Die endgültigen Systeme enthalten 52.000–68.000 Atome.

Die 13 IDP-Kraftfelder (FFs) und ihre entsprechenden Wassermodelle (WMs) (Details in Tabelle S1 und Sup. Info. Abschnitt Benchmark von Kraftfeldern (FFs) und Wassermodellen (WMs)): a03ws, a14sb3p, a19sbopc, a99disp, a99sb4pew, a99sbCufix3p, a99sbildn4pd, c22s3p, c27s3p, c36m2021s3p, c36m2021s3pm, c36m3pm und c36ms3p.

Der nicht gebundene Cutoff ist auf 12 Å eingestellt. Elektrostatische Wechselwirkungen wurden mit der Ewald-Methode für glatte Partikelnetze56 für Wechselwirkungen mit großer Reichweite und mit Coulomb für Wechselwirkungen mit kurzer Reichweite behandelt. Bei CHARMM-FFs wird das Lennard-Jones-Potenzial durch die Kraftschaltfunktion von GROMAC54,55 zwischen 8 und 12 Å modifiziert.

Die Länge der kovalenten Bindungen gelöster Stoffe und Wasser, an denen Wasserstoffatome beteiligt sind, wurde mit den Algorithmen LINCS57 bzw. SETTLE58 konstant gehalten, was die Integration von Bewegungsgleichungen mit einem Zeitschritt von 2 fs ermöglichte.

Für jedes System wurde eine Energieminimierung gefolgt von einem 1-ns-Äquilibrierungslauf mit konstantem Druck und Temperatur (NPT) bei 1 bar und 300 K durchgeführt. Die Temperatur wird durch den V-Rescale-Thermostat und der Druck durch den Berendsen-Barostat59,60 mit Zeitkopplung gesteuert Konstanten τT = 0,1 ps bzw. τP = 0,5 ps. Ein zweiter Äquilibrierungslauf wurde mit Nose-Hoover-Thermostat und Parrinello-Rahman-Barostat61,62,63 mit den Zeitkopplungskonstanten τT = 0,5 ps und τP = 2,5 ps für 1 ns durchgeführt.

Für den Produktionslauf wurde jedes der sechs Systeme 500 ns lang unter den gleichen Bedingungen wie im zweiten Äquilibrierungslauf simuliert, jedoch mit einem zufälligen Geschwindigkeits-Seed. Snapshots wurden alle 20 ps gespeichert. Die ersten 100 ns des Produktionslaufs wurden verworfen und die restlichen 400 ns wurden für die weitere Analyse verwendet.

Das obige Protokoll wurde auf jedes der 13 Kraftfelder angewendet, was eine kumulierte Flugbahn von 3 μs ergab.

Die Analyse der Snapshots wurde mit MDAnalysis64,65, MDtraj66, DSSP46,47 und unseren eigenen Skripten durchgeführt. Alle Figuren wurden mit Matplotlib44 (Python-Modul) aufgezeichnet.

Alle Rohwerte wurden linear neu skaliert, sodass sie zwischen 0,0001 und 1 liegen:

wobei \({S}_{norm,\mathrm{FF}}\) und \({S}_{raw,\mathrm{FF}}\) die normalisierten und rohen Werte für ein bestimmtes Kraftfeld (FF) sind. , jeweils.

Für jeden Schnappschuss wurde der Gyrationsradius (Rg) der Schweratome des 16-Reste-Trimers und der einzelnen Peptide mit MDAnalysis berechnet.

Die Rg-Verteilung des Trimers (Abb. 2 und Abb. S4) wurde mithilfe des Gaußschen Mischungsmodells an zwei Gaußsche Verteilungen angepasst.

Um die FFs zu bewerten, vergleicht der \({\text{Rg-Score}}_{FF,k}\) (Rohwert) die Simulationsergebnisse mit dem experimentellen \({Rg}_{exp,k}\) von k (U-förmig [gemittelt über 20 Modelle]: 10 Å oder L-förmig: 14,4 Å). Es wird wie folgt berechnet:

wobei \(\langle {Rg}_{FF,i}\rangle \) und \({SD}_{FF,i}\) der Durchschnitt bzw. die Standardabweichung der i-ten Gaußschen Funktion sind.

Der Rg der einzelnen Peptide wurde mit dem vorhergesagten \(R{g}_{FL}\) (10,8 Å) aus Florys Polymertheorie mit Parametern verglichen, die von Bernado und Blackledge43 für IDPs optimiert wurden:

wobei \({R}_{0}=\) 2,54 Å die Persistenzlänge ist, ν = 0,522 der exponentielle Skalierungsfaktor ist, N die Anzahl der Reste ist, \(R{g}_{FF,med}\) ist der Median Rg des FF und q3 und q1 sind das 75. bzw. 25. Perzentil.

Die Rohwerte aus (2) und (3) wurden normalisiert. Der endgültige Rg-Wert ist das normalisierte Produkt des normalisierten U-förmigen, L-förmigen und ungefalteten Rg (Tabelle 2).

Um die Schweratomkontakte in jedem Peptid zu analysieren, haben wir benutzerdefinierten Code zur Generierung von Kontaktkarten entwickelt. Ein Kontakt wurde als zwei Atome definiert, die sich innerhalb eines Abstands von 5 Å befanden, mit Ausnahme benachbarter Reste entlang der Proteinsequenz. Wir haben Intra-Peptid-Kontakte über alle Snapshots hinweg gezählt und Kontakthäufigkeiten < 1 % herausgefiltert. Anschließend wurden die durchschnittlichen Kontakthäufigkeiten für alle drei Peptide berechnet.

Beim Vergleich der durchschnittlichen Kontaktkarte aus jedem Schnappschuss mit der repräsentativen U-förmigen Konformation (Abb. 3) wurden Kontakte in eine von vier Gruppen eingeteilt [Tabelle 6; Wahr (T)/Falsch (F) Positiv (P)/Negativ (N)]. Ein Kontakt (kein Kontakt) gilt als positiv (negativ). Die Kontakte aus allen Schnappschüssen der sechs Replikate wurden in der Verwirrungsmatrix gesammelt (Tabelle S2).

Zur Messung der Übereinstimmung der Kontaktkarten wurde der Matthews-Korrelationskoeffizient (MCC)45 verwendet:

Beachten Sie, dass der MCC-Score zwischen −1 und 1 liegt. Ein MCC-Score von 1 zeigt eine perfekte Korrelation mit der Referenz an, 0 bedeutet keine Korrelation und −1 bedeutet eine vollkommen negative Korrelation. Der rohe MCC-Score wird dann normalisiert, um den normalisierten Intra-Peptid-Contact-Map-Score zu erhalten (Tabelle 3).

Wir haben die Konformation des Peptids in jedem Schnappschuss basierend auf seinen Kontakten mit anderen Peptiden als Monomer, Dimer oder Trimer klassifiziert (Tabelle S4). Es wurde definiert, dass das Monomer keinen Kontakt mit anderen Peptiden hatte, während das Dimer genau zwei Peptide in Kontakt hatte. Das Trimer zeichnete sich dadurch aus, dass jedes Peptid mit einem anderen Peptid in Kontakt stand. Zwei Peptide gelten als in Kontakt, wenn sie mindestens einen Kontakt haben. Wir verwenden die gleiche Kontaktdefinition wie bei der Intra-Peptid-Analyse.

Um das mittlere Peptid in Trimeren zu identifizieren, haben wir das Peptid mit den höchsten Interpeptidkontakten in der Fibrille bestimmt. Anschließend verglichen wir die berechnete Kontaktkarte mit der experimentellen Kontaktkarte des mittleren Peptids mit einem der beiden anderen Peptide.

Bei experimentellen Strukturen waren die Kontaktkarten des mittleren Peptids mit jedem der Randpeptide ähnlich, daher wählten wir Kette AB zum Vergleich mit den berechneten Kontaktkarten (siehe Abb. S7). Die gleiche Kontaktkarte wurde für Dimere verwendet.

Alle Kontakte zwischen zwei Kantenpeptiden in den Ensembles wurden als falsch positive Ergebnisse (FPs) gewertet. Wir haben die gleiche Methode wie im vorherigen Abschnitt verwendet, um Kontakte zu klassifizieren und die Matthews-Korrelationskoeffizienten-Bewertungen (MCC) zu berechnen (Tabelle S3).

Um Sekundärstrukturen zuzuordnen, verwendeten wir das Dictionary of Protein Secondary Structure (DSSP)46,47. Jeder Rest wurde entweder als α-Helix (H), β-Strang (E) oder Knäuel (C) klassifiziert.

Die Sekundärstrukturneigung/-wahrscheinlichkeit (\({p}_{i,ss}\), SSP) jedes Rests wird aus den Schnappschüssen berechnet, indem die Daten aller drei Peptide aus demselben FF kombiniert werden:

Dabei ist: i die Restposition im Peptid j zum Zeitpunkt t aus der mit dem Kraftfeld durchgeführten Simulation. ssi,j,t ist 1, wenn DSSP den entsprechenden Sekundärstrukturtyp ss zugewiesen hat, andernfalls 0. ss stellt den Sekundärstrukturtyp dar: α-Helix (H), β-Strang (E) oder Spirale (C).

Die Referenzsekundärstrukturen wurden aus den U-förmigen (20 Modelle) und L-förmigen (Einzelstruktur) Strukturen erhalten, wie in Tabelle S6 gezeigt. Der Sekundärstrukturwert des FF in Bezug auf die experimentelle Struktur k (U/L-förmig) beträgt:

wobei i die Restposition darstellt und \({exptl}_{k,i}\) die Sekundärstruktur des Rests i in der experimentellen Struktur k ist.

Für jedes FF ist der SSP-Score die logarithmische Wahrscheinlichkeit der Beobachtung der experimentellen Sekundärstrukturen. Die Wahrscheinlichkeiten haben wir aus den beobachteten Neigungen der Simulationen abgeleitet, unter der Annahme, dass die Positionen unabhängig voneinander sind.

Die SSP-Scores der rohen FF für die U-förmigen und L-förmigen Konformationen wurden unabhängig voneinander renormiert. Wir haben das Produkt dieser beiden normalisierten SSP-Scores genommen und sie erneut normalisiert, um den endgültigen SSP-Score zu erhalten (Tabelle 5).

Unter Verwendung der drei normalisierten Rg-Scores, SSP-Scores und Intrapeptid-MCC-Scores berechneten wir den Endscore für jeden FF, indem wir die Scores multiplizierten und das Produkt erneut normalisierten (Tabelle 1).

Daten sind auf begründete Anfrage bei HK verfügbar.

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MD-Simulationen wurden mit JAEA-Ressourcen des QST-Instituts und lokalen Ressourcen durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch das JSPS-Stipendium 2020 (FY2020 JSPS Postdoctoral Fellowship for Research in Japan (Short-term) to MC) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise auch von KAKENHI (JP18H05534), MEXT als „Program for Promoting Researches on the Supercomputer Fugaku“ (Biomolecular Dynamics in a Living Cell, JPMXP1020200101, hp220177) und der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (23ama121024j0002) unterstützt ).

Maud Chan-Yao-Chong

Aktuelle Adresse: Toulouse Biotechnology Institute, TBI, Universität Toulouse, CNRS, INRAE, INSA, 135, Avenue de Rangueil, 31077, Toulouse Cedex 04, Frankreich

Team für molekulare Modellierung und Simulation (MMS), Institut für Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology (QST), 4-9-1, Anagawa, Inage Ward, Chiba City, Chiba, 263-8555, Japan

Maud Chan-Yao-Chong, Justin Chan und Hidetoshi Kono

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MC, JC und HK planten das Forschungsprojekt. MC hat alle Simulationen durchgeführt. MC und JC analysierten die Daten. MC, JC und HK haben den Manuskripttext geschrieben und überprüft. Das Manuskript wurde durch Beiträge aller Autoren verfasst. Alle Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt. Diese Autoren haben gleichermaßen dazu beigetragen.

Korrespondenz mit Hidetoshi Kono.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chan-Yao-Chong, M., Chan, J. & Kono, H. Benchmarking von Kraftfeldern zur Charakterisierung der intrinsisch ungeordneten R2-FUS-LC-Region. Sci Rep 13, 14226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40801-6

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Eingegangen: 26. Dezember 2022

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40801-6

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